左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

冯秀芝 吴继雷 药晓雨 任艳玲*

1. 辽宁中医药大学中医学院，辽宁 沈阳 110847 2. 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

现代医学对绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的发病机制研究逐步深入，可概括为骨代谢稳态失衡。根据中医学肾之精气、阴阳理论，女性在绝经后，肾精亏虚，天癸竭绝，加之阴阳关系失衡，出现骨髓空虚，任物无力。左归丸和右归丸是明代张景岳创制的经典名方，用药注重阴阳既济，能显著改善PMOP患者血清学和组织学指标。前期实验研究也证实左、右归丸能促进PMOP大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化，然而作用机制尚不十分明确。AMP(adenosine 5'-monophosphate ) 依赖的蛋白激酶(AMPK)是生物能量代谢调节的关键分子，是细胞内最重要的能量感受器，对维持细胞的能量平衡具有关键调节作用，几乎参与细胞所有的生长代谢活动，是研究代谢性疾病的核心。本研究将基于AMPK/mTOR信号通路探讨左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的影响，以期阐明左、右归丸治疗PMOP的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级2月龄雌性大鼠60只，体质量180～220 g，购买于辽宁长生生物技术有限公司，经营许可证号为SCXK(辽)2015-0001。

1.1.2药物组成：实验过程中所用中药饮片均购自辽宁中医药大学附属医院。左归丸方剂组成：熟地黄24 g、山萸肉12 g、麸炒山药12 g、枸杞12 g、牛膝9 g、菟丝子12 g、龟甲胶12 g、鹿角胶12 g(《中药部颁标准》)；右归丸方剂组成：熟地黄24 g、麸炒山药12 g、山萸肉12 g、枸杞12 g、菟丝子12 g、黑顺片6 g、肉桂6 g、当归9 g、杜仲9 g、鹿角胶12 g(《中华人民共和国药典》2015版·第一部)。将上述药方用蒸馏水煎煮，制成浓缩煎剂。补佳乐(戊酸雌二醇片，生产企业：DELPHARM Lille S.A.S.药品批准文号：国药准字J20171038)研磨成粉末状，加入蒸馏水，按照一定体积制成混悬液。

1.1.3仪器与试剂：倒置显微镜(Leica，美国)，二氧化碳恒温培养箱(Thermo，美国)，流式细胞仪(BD，美国)，紫外可见分光光度计，生物安全柜(Thermo，美国)；改良型α-MEM培养液(HyClone)，胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015，德国)，0.25 %胰蛋白酶(Sigma)，APC anti-mouse/rat CD29，PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90/mouse CD90.1 (Thy-1.1) Antibody，PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45 Antibody，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒(Solarbio，货号BC2142)等。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组及处理方案：将60只2月龄雌性SPF级SD大鼠随机分为6组，分别为空白组(KB)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、补佳乐组(BJL)、右归丸组(YGW)、左归丸组(ZGW)，每组10只。于动物实验中心(室温20 ℃～25 ℃，湿度30 %～35 %)适应性喂养7 d后，除KB组和SHAM组外，进行双侧卵巢摘除术，SHAM组模拟手术过程，仅摘除卵巢附近少许脂肪组织，KB组不做处理，术后3 d开始灌胃给药。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”，换算得出各给药组以成人给药量的6.3倍(以单位体重计)剂量进行灌胃给药，具体如下：BJL组、YGW组、ZGW组分别按照0.09 mg/kg、10.26 g/kg、9.45 g/kg的灌胃量给药，生药量为1 g/mL。SHAM组和OVX组以1 g/kg蒸馏水灌胃，每日1次，灌胃12周。

1.2.2骨髓间充质干细胞分离培养及成骨分化诱导:以上述方案灌胃12周后，取大鼠股骨与胫骨BMSCs进行培养，以差时贴壁法得到大鼠原代BMSCs，待原代细胞融合至85 %～90 %时进行首次传代，于第三代进行细胞鉴定并加入成骨分化诱导液继续培养，9 d后进行相关实验。取材具体操作方案及成骨分化诱导液组成与前期实验相同[1]。

1.2.3BMSCs鉴定：取生长期细胞观察细胞形态；将P3代细胞浓度调整为1×105/mL，分别加入APC anti-mouse/rat CD29、PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90、PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4ALP活性检测：用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组ALP活性。取成骨诱导10 d细胞培养上清液，4 ℃、10 000 r/min 离心8 min，取上清液待测。按试剂盒操作步骤将相应试剂和待测样品按顺序混匀，并设空白孔和标准孔，于 510 nm 处测定吸光度，计算各组碱性磷酸酶活性。

1.2.5BMSCs成骨诱导后矿化结节的观察：取P3代细胞经胰酶消化后以5×107/L接种于24孔板，以成骨诱导液培养9 d后弃培养液，以PBS清洗2次，以乙醇(95 %)固定10 min，PBS清洗3次后进行茜素红染色，自来水冲洗并常温干燥后于显微镜下观察矿化结节的形成。

1.2.6Runx 2蛋白、AMPK /mTOR信号通路相关蛋白检测：取成骨诱导液培养9 d细胞，以PBS清洗3次，甩干，将细胞刮至一角，每瓶(25 cm2)细胞加入100 μL细胞裂解液，冰上静置30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清；配制SDS-PAGE分离胶，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，每孔上样25 μL，电泳后用半干法进行转膜3 h，封闭液封闭后，Ⅰ抗(稀释比：Runx 2、p70S6K1、p-p70S6K1为1∶500，AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR为1∶1 000)37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜后，用TBST溶液清洗5次，置Ⅱ抗孵育液中37 ℃孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，暗室加入ECL发光液，曝光，扫描图像，检测条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白(β-actin)条带的吸光度比值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察

原代细胞培养24 h后少量细胞贴壁，呈透亮圆形，3 d后贴壁细胞增多，5 d后进行首次换液，贴壁细胞形成许多突触，细胞呈多角形、扁长的菱形或梭形，传代后细胞融合，呈长梭形，可见旋涡状分布。见图1。

图1 BMSCs倒置显微镜下形态Fig.1 The morphology of BMSCs under an inverted microscope注：A：P2代2 d，B：P3代4 d。

图2 BMSCs流式细胞仪鉴定结果Fig.2 Flow cytometry identification results of BMSCs

2.2 BMSCs的流式细胞仪鉴定结果

P3代细胞经流式细胞仪检测细胞表面抗原，结果是APC anti-mouse/rat CD29和PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90呈阳性，阳性率分别是99.7 %和99.5 %；PE anti-rat CD11b/c和PE/Cy7 anti-rat CD45呈阴性，阴性率分别是3.3 %和1.2 %。见图2。

2.3 左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs ALP活性的影响

实验结果显示，KB组与SHAM组比较，ALP活性无显著性差异(P>0.05)；OVX组与SHAM组比较，ALP活性明显降低，有显著性差异(P<0.05)；与OVX组比较，三个用药组均能提高ALP活性，有显著性差异(P<0.05)；三个用药组比较，ZGW组提高ALP活性作用最明显，BJL组与YGW组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.4 左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后矿化结节的影响

与KB组比较，OVX组矿化结节数量明显减少；与OVX组比较，三个用药组矿化结节数量明显增多，且ZGW组优于YGW组，YGW组优于BJL组。见图3。

表1 各组BMSCs成骨诱导后ALP活性

图3 左、右归丸对BMSCs成骨诱导后茜素红染色矿化结节形成的影响Fig.3 Effect of Zuo and Yougui Pills on the formation of mineralized nodules by alizarin red staining after osteoinduction of BMSCs

2.5 左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后Runx 2蛋白表达的影响

与KB组比较，OVX组Runx 2蛋白表达水平下降，有显著性差异(P<0.05)；与OVX组比较，各用药组Runx 2蛋白表达水平均有不同程度的升高，说明各用药组均能促进去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，有显著性差异(P<0.05)，其中BJL组和ZGW组优于YGW组，BJL组和ZGW组无显著性差异。见图4。

图4 左、右归丸对BMSCs成骨诱导后Runx2蛋白表达水平的影响Fig.4 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of Runx2 protein after BMSCs osteoinduction注：与KB组比较，●P<0.05；与OVX组比较，★P<0.05；与BJL组比较，□P<0.05；与YGW组比较，△P<0.05。

2.6 左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

与KB组比较，OVX组AMPKα蛋白磷酸化水平升高，有显著性差异(P<0.05)；与OVX组比较，各用药组AMPKα蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低，有显著性差异(P<0.05)；与BJL组比较，ZGW组和YGW组AMPKα蛋白磷酸化水平降低，有显著性差异(P<0.05)；ZGW组和YGW组比较无显著性差异。见图5。

与KB组比较，OVX组mTOR蛋白磷酸化水平降低，有显著性差异(P<0.01)；与OVX组比较，三个用药组mTOR蛋白磷酸化水平升高，有显著性差异(P<0.05)；三个用药组相比，BJL组和ZGW组mTOR蛋白磷酸化水平高于YGW组，有显著性差异(P<0.05)，BJL组与ZGW组相比无显著性差异。见图6。

与KB组比较，OVX组p70S6K1蛋白磷酸化水平降低，有显著性差异(P<0.05)；与OVX组比较，各用药组p70S6K1蛋白磷酸化水平均有不同程度的升高，有显著性差异(P<0.05)；三个用药组相比，BJL组与YGW组无显著性差异，ZGW组p70S6K1蛋白磷酸化水平明显高于BJL组和YGW组，有显著性差异(P<0.05)。见图7。

图5 左、右归丸对BMSCs成骨诱导后AMPKα蛋白磷酸化水平的影响Fig.5 The effect of Zuo and Yougui pills on AMPKα protein phosphorylation after osteoinduction of BMSCs注：与KB组比较，●P<0.05；与OVX组比较，★P<0.05；与BJL组比较，□P<0.05。

图6 左、右归丸对BMSCs成骨诱导后mTOR蛋白磷酸化水平的影响Fig.6 The effect of Zuo and Yougui pills on the phosphorylation level of mTOR protein after osteoinduction of BMSCs注：与KB组比较，●P<0.05；与OVX组比较，★P<0.05；与BJL组比较，□P<0.05；与YGW组比较，△P<0.05。

图7 左、右归丸对BMSCs成骨诱导后p70s6k1蛋白表达水平的影响Fig.7 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of p70s6k1 protein after osteogenic induction of BMSCs注：与KB组比较，●P<0.05；与OVX组比较，★P<0.05；与BJL组比较，□P<0.05；与YGW组比较，▽P<0.05。

3 讨论

现代医学认为女性绝经后雌激素水平的骤然下降是PMOP发生的主要原因，动物实验研究和临床研究皆显示外源性雌激素或雌激素受体调节剂能通过多种作用机制抑制破骨细胞活性、提高成骨细胞的骨形成作用，提高骨密度，从而有效防治PMOP。但雌激素治疗会带来许多副作用，如增加子宫内膜增生、冠状动脉疾病和静脉血栓栓塞等的发病风险[2]。中医学认为PMOP以肾精亏虚为本，继之阴阳失衡，“阳化气、阴成形”功能失调，从而出现相关的病机变化和临床症状，中医药防治PMOP有确切的临床疗效[3]。左、右归丸为PMOP(骨痿)中医药诊疗指南(2019年版)推荐用药[4]。左、右归丸基于“精不足者，补之以味”“阴阳既济”立法，其中左归丸以滋补肾之阴精为主，辅之以温阳；右归丸以温补肾阳为主，辅之以滋阴。“阳化气，阴成形”高度概括了阴阳之功能，阳气主动，在机体生长壮老已的新陈代谢活动中主要发挥气化推动作用；阴精主静，构成有形物质本身，并主有形物质的化生。左、右归丸通过补肾填精，或以滋补阴精为主，辅以温阳，阳中求阴，或以温补肾阳为主，辅以滋阴，阴中求阳，以期阴阳互济，纠正PMOP阴阳功能失衡的病理状态。

AMPK/mTOR信号通路是细胞能量代谢的调控枢纽，对细胞的生长代谢活动具有极其重要的意义。mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，在细胞的生长、增殖调节中起关键作用[5]。AMPK是细胞内的能量感受器，被激活后通过磷酸化TSC2、抑制mTOR信号通路从而抑制细胞的合成代谢和细胞生长，而上调细胞分解代谢相关基因，增强细胞的自噬水平，从而促进细胞能量产生，减少能量消耗，恢复AMP/ATP比值，以适应内外环境的变化[6-9]。文献研究[10-11]显示，激活AMPK能明显抑制BMSCs的成骨分化，但亦有相反状况。也有研究[12]显示过度激活AMPK能促进MC3T3-E1细胞的成骨并通过AMPK-Gfi1-OPN轴抑制3T3-L1细胞的成脂。一项糖尿病相关的骨丢失机制的研究[13]发现在没有Mst1/2激酶的情况下，葡萄糖转运蛋白Glut1的表达会丢失，并导致AMPK的激活和Runx2蛋白酶体的降解。另一方面有研究[14]提示AMPK的激活对成骨分化的促进或抑制作用与时间相关，颅骨成骨细胞和MC-3T3细胞在分化早期表达激活的AMPK，但是持续性激活的AMPK则会抑制成骨分化；他们的后续研究发现成骨分化的早期需要激活AMPK，促进分解代谢保证分化早期成骨细胞的能量需求，但在第9天后则需要下调AMPK的磷酸化，以满足分化后期合成代谢的需要。也有研究者[15]认为骨代谢与能量代谢之间具有更为复杂的关系，而不是简单的促进或抑制。因此，AMPK的激活对成骨分化的具体影响及其机制还有待于进一步研究。

前期研究[16-18]结果显示，左、右归丸能有效干预PMOP大鼠BMSCs的成骨与成脂分化平衡，二者均能促进PMOP大鼠BMSCs的成骨分化，且左归丸优于右归丸；二者均能抑制BMSCs的成脂分化，并且与TGF-β/Smad以及Smad-ERK信号级联有关。本课题体内动物实验研究结果显示，与KB组比较，OVX组大鼠腰椎骨密度明显降低，骨组织形态改变，骨小梁数量减少，排列紊乱，骨髓腔增大；左、右归丸能增加PMOP大鼠腰椎骨质密度，改善PMOP大鼠股骨组织形态，以左归丸效果最为明显；左、右归丸能影响OVX大鼠的脂质代谢、脂肪组织分布及形态，以右归丸效果更明显；左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织PICP、OPG、TRAP、RANKL等骨代谢指标均有不同程度的影响，上述影响皆与AMPK/mTOR信号通路有关[19-21]。体外细胞实验研究结果显示，左、右归丸能提高去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后ALP活性，明显增加其成骨诱导后矿化结节的形成，并能提高其Runx 2蛋白的表达水平，因此，左、右归丸能促进去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，改善成骨诱导后的骨形成指标，以左归丸效果更佳，其中的作用机制可能是通过AMPK /mTOR信号通路参与了BMSCs的成骨分化。对实验结果进行分析得出OVX组AMPKα蛋白的磷酸化水平较KB组显著升高，mTOR信号通路相关蛋白磷酸化水平则降低，激活了细胞的能量代谢过程，抑制了细胞的合成代谢。左、右归丸均能降低AMPKα蛋白的磷酸化水平，从而激活mTOR信号通路，提高mTOR和p70S6K1蛋白的磷酸化水平。因此左、右归丸可能通过AMPK/mTOR信号通路抑制细胞的分解代谢，促进其合成代谢，提高BMSCs的成骨分化能力，增强成骨细胞的成熟、功能和活性，从而调整BMSCs的骨脂分化平衡。

综上所述，左归丸在影响PMOP大鼠BMSCs的骨脂分化平衡方面效果优于右归丸，而右归丸在调节PMOP大鼠脂质代谢方面的作用优于左归丸，近年来，骨髓脂肪组织在骨质疏松症中发挥的作用正引起人们的关注，右归丸防治PMOP的作用机制除了影响BMSCs的骨脂分化平衡外，对骨髓脂肪组织的形成及生物学调控作用的影响将是下一步的研究方向。