碘乙酸钠大鼠骨关节炎模型骨微结构研究

鲍哲明 单青 李晨 陈孟莉*

1.中国人民解放军总医院，北京 100089 2.中国人民解放军联勤保障部队第960医院骨科，山东 济南 250031

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种由年龄、创伤、炎症等多种因素相互作用引起的关节软骨退行性改变，软骨损伤是OA的重要表现，OA的病理、生理改变不止是软骨的损伤修复，同时也存在关节软骨下骨的结构改变，在OA的形成和发展病理过程中相互促进、相互影响[1]。大量研究[2]证明软骨下骨结构和生物力学改变与软骨退变存在一定的相关性。

动物模型是研究骨关节炎病理机制和治疗的常用方法之一，主要分为药物诱导、关节制动、手术诱导和自发性OA、转基因动物模型等[3]。碘乙酸钠(monosodium Iodoacetate, MIA)作为一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶抑制剂，能够抑制软骨细胞代谢，引起软骨细胞凋亡，导致软骨细胞外基质降解。MIA诱导的大鼠OA模型会出现关节软骨的破坏，软骨下骨结构损伤、炎症反应和关节疼痛等改变[4]。

本研究采用大鼠膝关节腔中注射MIA的方法建立大鼠OA模型，并通过Micro-CT以及组织切片等途径来观察关节软骨及软骨下骨微结构的改变，探讨MIA造模后不同时段OA模型的病理改变以及OA不同阶段软骨下骨微结构的变化特点，进一步明确软骨改变对软骨下骨微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取SPF级8周龄雄性Wistar大鼠36只，体重为240～260 g，许可证号SCXK(京)2019-0010，饲养于中国人民解放军总医院医学实验动物中心。所有大鼠基础饲料喂养，能够自由活动、摄食和饮水。本研究经中国人民解放军总医院实验动物伦理委员会批准，编号为SQ2020127。

1.1.2实验试剂及器材：碘乙酸钠(阿拉丁，中国)，4 %多聚甲醛溶液(Servicebio，中国)，10 % EDTA溶液(Servicebio，中国)，甲苯胺蓝染液(Servicebio，中国)，番红固绿染液(Servicebio，中国)；微量进样器(50 μL，上海安亭，中国)，小动物Micro-CT(Quantum GX，PerkinElmer，美国)，光学显微镜(Eclipse E100，尼康，日本)，电子天平(XS105DU，Mettler Toledo，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1分组及处理方法：将36只Wistar大鼠编号，使用随机数字法分成3组，每组12只，分别为空白对照组(Sham组)、OA造模2周组(OA-2W组)、OA造模4周组(OA-4W组)。配置60 g/L 浓度MIA的0.9 %生理盐水溶液。将大鼠腹腔注射45 mg/kg剂量的戊巴比妥钠进行麻醉。OA造模组采用微量进样器抽取配好的碘乙酸钠溶液50 μL，于右膝关节髌骨下中间偏外侧关节间隙斜45 °穿刺后推入MIA溶液，同法Sham组右膝关节注射等量生理盐水溶液。所有大鼠饲养在相同的鼠笼内并自由活动4周，Sham组和OA-4W组自饲养的第1周开始注射，造模4周；OA-2W组自饲养的第3周时注射，造模2周。

1.2.2标本取材处理：所有大鼠饲养4周后，采用过量麻醉后颈椎脱臼法处死。固定消毒后，纵行切开大鼠右膝关节皮肤、皮下组织，暴露膝关节腔。骨剪离断右侧包含胫骨上端约2 cm的膝关节骨头，去除附着的软组织、肌肉组织等，随即放置于4 %多聚甲醛溶液固定48 h备用。

1.2.3Micro CT扫描与分析将取下固定的膝关节胫骨竖直平放入样品槽内，使标本纵轴垂直于射线。扫描参数：电流114 mA，电压70 kV，视野25 mm，体素尺寸50 μm，曝光时间14 min。将扫描结果导入Analyze 12.0软件进行骨微结构的定量分析，选取胫骨平台下50层厚度为感兴趣区域(region of interest，ROI)，测量结果包括松质骨的骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁连接密度(connectivity density, Conn.D)，将扫描后的图像导入Mimics Research 21.0进行三维图像重建，获得胫骨平台图像。

1.2.4组织学评价：将胫骨近端标本放入4 %多聚甲醛溶液中固定48 h后，放入10 % EDTA脱钙液脱钙约4周，梯度脱水，浸蜡包埋，所有样本取冠状位纵切，厚度4～5 μm。分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、甲苯胺蓝染色、番红固绿染色。通过显微镜观察切片并拍照，OA组织学评价采用OOCHAS(osteoarthritis cartilage histopathology assessment system)评分方法[5]，由双盲的独立第三者计数评分，每个标本取三张连续切片观察计分。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Micro-CT扫描图像结果

三维重建图像可见(图1)，Sham组关节面光滑平整;OA-2W组关节面粗糙，可见局部软骨缺损，部分区域有溃疡形成，关节周缘少许骨赘形成;OA-4W组可见关节表面软骨大量缺损，关节面极度粗糙，软骨下骨质裸露，关节周缘大量骨赘形成。

冠状剖面图像可见(图2)，Sham组软骨下骨小梁结构均匀，排列整齐有序;OA-2W组骨小梁稀疏，出现镂空现象，且骨小梁变薄，骨小梁连接减少，部分骨小梁结构排列紊乱;OA-4W组骨小梁稀疏程度更加严重，骨小梁间出现大量缺损，部分骨小梁连接中断，网状结构消失。

图1 大鼠膝关节胫骨端Micro-CT三维重建图像Fig.1 Micro-CT 3D reconstruction image of knee tibia in rats

图2 大鼠膝关节胫骨端Micro-CT冠状剖面图像Fig.2 Micro-CT coronal section image of knee tibia in rats

2.2 软骨下骨微结构参数

2.2.1骨密度与骨量：与Sham组相比，MIA造模后胫骨软骨下出现了骨密度下降、骨量降低的情况，且随着造模时间增加而逐渐加重。Sham组软骨下松质骨BMD平均为(1 367.97±37.43)mg/cc，OA-2W组软骨下松质骨BMD平均为(1 330.66±38.99)mg/cc(t=2.060，P=0.047 6)。而OA-4W组BMD下降至(1 285.5±47.08)mg/cc(t=5.143，P<0.000 1)。Sham组BV/TV平均为(38.22±3.284)%，OA-2W组相比下降至(30.72±5.122)%(t=4.563，P<0.000 1)，OA-4W组持续下降至(25.81±2.608)%(t=8.068，P<0.000 1)。见图3。

2.2.2骨小梁结构：与Sham组相比，MIA造模后软骨下骨小梁结构出现稀疏改变，骨小梁变薄，软骨下骨质疏松进一步加重。Sham组Tb.Th平均为(0.191 2±0.029 3)mm，OA-2W组下降至(0.175 0±0.019 4)mm(t=1.074，P=0.291 8)，OA-4W组下降至(0.141 4±0.029 9)mm(t=4.595，P<0.000 1)。Sham组Tb.Sp平均为(0.428 8±0.071 0)mm，OA-2W组升高至(0.475 0±0.090 3)mm(t=1.249，P=0.222 0)，OA-4W组升高至(0.530 7±0.089 3)mm(t=2.945，P=0.006 4)。Sham组Conn.D平均为(57.94±8.050)mm-3，OA-2W组下降至(52.39±8.781)mm-3(t=1.727，P=0.096 0)，OA-4W组下降至(45.48±10.14)mm-3(t=3.368，P=0.002 4)，见图3。

2.2.3组织切片染色及评分：通过显微镜下观察HE染色切片、甲苯胺蓝染色切片和番红固绿染色切片可见(图4)，Sham组关节表面平整，软骨细胞排列整齐。细胞及软骨基质染色正常，没有减退现象；OA-2W组软骨表面粗糙出现裂隙，软骨表层变薄，软骨细胞形态不规则，呈团簇样聚集，软骨表面纤维化，深层软骨细胞出现肥大，空泡状改变，表层软骨失染，部分软骨染色减退；OA造模4周后可见软骨表面大面积溃疡缺损，部分软骨下骨质裸露，软骨表面覆盖大量的纤维素，软骨细胞数量减少，细胞排列紊乱，局灶性细胞坏死，仅存少数淡染区域甚至全部失染。软骨组织切片OOCHAS评分，Sham组平均为0(0,1)分，OA-2W组平均为12(9.75,15)分，较Sham组相比差异有统计学意义(P=0.004 7)，OA-4W组平均为24(20,24)分，较Sham组相比差异有统计学意义(P<0.000 1)。见图5。

图3 大鼠胫骨软骨下骨微结构参数Fig.3 Subchondral bone microstructural parameters of knee tibial in rats注：OA-2W组、OA-4W组与空白组之间分别进行比较，nsP≥0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。

图4 大鼠膝关节胫骨软骨面HE染色切片、甲苯胺蓝染色切片和番红固绿染色切片Fig.4 HE staining section, toluidine blue staining section and Safranin-Fast Green Staining section of knee tibial cartilage surface in rats注：SBP：软骨下骨板；AC：关节软骨；比例尺：100 μm。

图5 大鼠膝关节胫骨软骨组织OOCHAS评分Fig.5 OOCHAS score of knee tibial cartilage in rats注：OA-2W组、OA-4W组与空白组之间分别进行比较，**P<0.01，****P<0.000 1。

3 讨论

骨关节炎动物模型是研究骨关节炎病理机制和治疗方法的重要途径。OA模型通常分为自发性模型和继发性模型。继发性模型主要包括侵入性模型和非侵入性模型，是目前最为常用的造模方式[6]。侵入性模型包括手术诱导和化学诱导两种方式。手术诱导的优点是可重复性好，造模时间短，文献报道[7]用于研究的时间长，材料方法获取方便，对于技术要求低。缺点是与人类自然发生的退变性OA的变化特点相似性较差，存在感染的风险，由于造模速度快，对于慢性病理特点的研究效果较差；化学诱导方法无需手术，能够减少潜在的感染风险，相对于手术造模侵入性更小。MIA作为一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶抑制剂，是目前最常用的化学造模方法。Morais等[8]在关节腔内注射MIA后发现，OA模型表现出软骨细胞的变性和凋亡，能够造成软骨损伤，与人体骨关节炎症状十分相似。很多学者使用MIA造模后，对于造模时间与OA严重程度的关系，没有一个准确的判断，这就给使用动物模型研究疾病带来了很大的不确定性和困难。既往学者报道[9-10]随着注射MIA浓度剂量增加，OA的严重程度会逐渐加重，局部关节注射1.5～3 mg MIA造模1周后即可产生明显的OA改变。本研究在使用3 mg MIA膝关节注射2周后发现，大鼠的膝关节软骨表面出现了局部软骨缺损，软骨表面不规则，属于OA疾病中期的病理表现。而在造模4周后可见关节表面软骨大量缺损，软骨下骨质裸露，关节周缘大量骨赘形成，属于晚期的OA程度。

软骨下骨对表面的关节软骨起到重要的减震功能，可以通过重塑在关节活动期间不断适应机械环境的变化，衰减约30 %的关节负荷[11]。既往研究[12]表明，OA发病过程中的各种原因可能会导致软骨下骨吸收和骨重塑，进而引起关节软骨应力改变导致退行性变加重。因此研究OA发生时软骨下骨的骨微结构改变，有助于我们更好的了解骨关节炎疾病的病理进展特点。

许多研究[13]发现人体非膝骨性关节炎软骨下骨密度与软骨厚度间存在正相关性，即软骨越薄，软骨下骨密度越低。在手术诱导OA造模的研究中，有学者[14]发现早期关节软骨下骨及骨小梁厚度降低，骨吸收增加导致骨密度下降，晚期虽然会有软骨下骨骨形成增加，骨赘形成，但其下方的松质骨丢失严重，骨小梁进一步变薄[15]。Siebelt等[16]注射木瓜蛋白酶造模后也发现随着时间推移，软骨下骨板会变薄，出现孔隙率增高，骨小梁丢失，骨量降低等表现。本研究通过使用MIA对大鼠进行OA造模发现，随着造模时间延长，OA程度逐渐加重，软骨下骨会出现骨质疏松，骨密度下降，松质骨会呈现骨小梁变薄，骨分离度增加，骨小梁连接密度下降的情况，并且这种情况会随着OA严重程度加重而逐渐加重。在造模4周后达到OA的晚期阶段，并没有出现很多文章中报道的OA软骨下骨密度增高的情况[17]。

结合以往的动物实验和人体的相关研究结果，笔者推测在OA早期，骨吸收活跃，新生骨组织矿化率低，会出现软骨下骨密度降低，骨小梁变薄，造成骨小梁间隙增大，导致软骨下骨板结构出现破坏。在人体的OA发展过程中，早期软骨下骨小梁连接密度的下降会造成软骨下骨在缓冲软骨受到的应力方面能力下降。但随着人体OA的进展，膝关节软骨磨损加重，关节会逐渐通过代偿出现关节畸形，促使软骨下负重能力发生改变，为了提供更多的载荷以承载缓冲关节承受的冲击，软骨下骨发生代偿性致密改变，造成了晚期部分区域骨密度增高的现象[18]。关节腔内注射MIA等药物引起的软骨损伤退变，由于造模时间短，病情进展快，不会出现人类自然病情发展过程中由于承受膝关节应力负荷而导致软骨下骨代偿性骨密度增加的情况。本研究对动物进行OA造模的时候，短期内就可以模拟OA从轻度到重度的病理改变过程，软骨下骨呈现的骨密度下降、骨质疏松改变，可能是关节内炎性破坏本身造成的直接结果。

本研究采用的是药物注射形成关节内炎性反应、破坏关节软骨来模拟OA的形成，相比于手术造模等其他方法，可能和人体创伤形成的OA存在一定的区别。另外，在造模的过程中，由于空白组注射后干预4周，没有设立同OA造模2周组对比的空白注射2周组，并且组之间可能存在个体及活动能力的差异，给实验结果带来偏倚。

通过对大鼠膝关节注射MIA进行OA造模，发现在MIA造模2周时达到OA中期阶段，造模4周时为OA晚期阶段，这为将来更好的应用动物OA模型形成了理论依据。同时通过对软骨下骨的骨微结构分析发现，OA会造成软骨下骨密度减低、骨小梁稀疏等骨质疏松表现，并且随着OA病情进展，这种情况会逐渐加重。