不同基源羌活含量测定和指纹图谱结合化学模式识别研究

2020-07-09王倩王相杨梦婷王鑫国牛丽颖

中国中医药信息杂志 2020年6期

王倩，王相，杨梦婷，王鑫国，牛丽颖

王倩1，王相1，2，3，杨梦婷1，王鑫国1，2，3，牛丽颖1，2，3

1.河北中医学院，河北石家庄 050091；2.河北省中药配方颗粒技术创新中心，河北石家庄 050091；3.河北省高校中药配方颗粒应用技术研发中心，河北石家庄 050091

建立不同基源羌活药材的超高效液相色谱含量测定及指纹图谱分析方法，为其质量评价提供依据。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.3 mL/min，检测波长246 nm，柱温35 ℃，进样量2 μL。根据含量测定及指纹图谱结果，通过相似度评价、聚类分析、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）评价30批羌活样品的质量。羌活醇、异欧前胡素在该条件下分离良好，且有较宽的线性范围和良好的线性关系（＝1.000 0），平均回收率分别为99.85%、101.41%，RSD分别为1.31%、1.48%。指纹图谱在该条件下分离效果较好，出峰时间适中，出峰数量较多，基线平稳，方法稳定。筛选出15个共有峰，指认出2个成分。羌活和宽叶羌活样品的相似度分别为0.719～0.981、0.985～0.999。聚类分析、PCA及OPLS-DA将30批羌活样品分为两类，并筛选出羌活醇、异欧前胡素等10个对组分差异影响较大的成分。本研究建立的方法可快速鉴别并评价羌活药材的基源与质量，为其内在质量控制提供参考。

羌活；指纹图谱；聚类分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判别分析

羌活为伞形科植物羌活Ting ex H. T. Chang或宽叶羌活H. de Boiss的干燥根及根茎，功效解表散寒、祛风除湿、通痹止痛，是治疗四时风寒湿痹之要药，临床多用于风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛和肩背酸痛[1]。现代研究表明，羌活具有抗炎、镇痛、解热、抗心律失常、抗心肌缺血和抗菌等作用[2-9]。目前对于药用羌活的化学成分、药理作用、生药学、临床应用及羌活属植物系统分类、濒危诱因等方面研究比较广泛。近年来，不同基源羌活的临床疗效和所含化学成分的差异问题逐渐受到重视，并对不同基源羌活进行了分析研究。2015年版《中华人民共和国药典》收录了性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别及羌活醇、异欧前胡素成分总量控制羌活的质量，但羌活化学成分复杂，且基源和产地因素对羌活化学成分的组成和含量均有一定影响[10-12]，因此，客观、全面评价羌活质量具有重要意义。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立30批不同基源羌活含量测定方法及指纹图谱，筛选共有峰，通过相似度评价、聚类分析、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）比较不同基源羌活样品之间的差异，为完善羌活药材的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Waters超高效液相色谱ACQUITY H-Class系统，包括四元溶剂管理器（QSM）、自动进样器（SMFTN）、二极管阵列检测器（PDA）、高温柱温箱（CHA）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Empower 3色谱工作站，美国沃特世公司；TB-215D 电子分析天平、BSA224S-CW电子分析天平，北京赛多利斯；KQ-250型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品羌活醇（批号111820-201705）、异欧前胡素（批号110827-201611），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。30批羌活样品均由河北神威药业有限公司统一采购，经河北省药品检验研究院孙宝惠主任药师鉴定，S1～S15为伞形科植物羌活Ting ex H.T.Chang的干燥根及根茎，S16～S30为伞形科植物宽叶羌活H. de Boiss的干燥根及根茎。样品来源信息见表1。

表1 30批羌活样品来源信息

编号基源产地编号基源产地 S1羌活四川省阿坝州1 S16宽叶羌活甘肃省合川镇1 S2羌活四川省阿坝州2 S17宽叶羌活甘肃省合川镇2 S3羌活四川省阿坝州3 S18宽叶羌活甘肃省合川镇3 S4羌活四川省阿坝州4 S19宽叶羌活甘肃省合川镇4 S5羌活四川省阿坝州5 S20宽叶羌活甘肃省合川镇5 S6羌活四川省凉山州1 S21宽叶羌活甘肃省渭源县1 S7羌活四川省凉山州2 S22宽叶羌活甘肃省渭源县2 S8羌活四川省凉山州3 S23宽叶羌活甘肃省渭源县3 S9羌活四川省凉山州4 S24宽叶羌活甘肃省渭源县4 S10羌活四川省凉山州5 S25宽叶羌活甘肃省渭源县5 S11羌活四川省甘孜州1 S26宽叶羌活甘肃省宕昌县1 S12羌活四川省甘孜州2 S27宽叶羌活甘肃省宕昌县2 S13羌活四川省甘孜州3 S28宽叶羌活甘肃省宕昌县3 S14羌活四川省甘孜州4 S29宽叶羌活甘肃省宕昌县4 S15羌活四川省甘孜州5 S30宽叶羌活甘肃省宕昌县5

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，5%～8%A；2～3 min，8%～10%A；3～4 min，10%～15%A；4～5 min，15%～20%A；5～6 min，20%～21%A；6～7 min，21%～21.4%A；7～8.5 min，21.4%～21.5%A；8.5～9 min，21.5%～21.8%A；9～9.2 min，21.8%～22%A；9.2～9.5 min，22%～28%A；9.5～11 min，28%～48%A；11～13 min，48%～53%A；13～15 min，53%A；15～17 min，53%～80%A；17～19 min，80%～15%A；19～21 min，15%～5%A；21～27 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；检测波长：246 nm；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。混合对照品及不同基源羌活供试品UPLC图见图1。

注：A.混合对照品；B.羌活供试品；C.宽叶羌活供试品；13.羌活醇；14.异欧前胡素

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液

取羌活醇和异欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL分别含羌活醇0.063 0 mg/mL、异欧前胡素0.032 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取羌活样品粉末0.25 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加70%甲醇25 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，过滤，滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系

精密吸取对照品溶液0.4、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，分别以羌活醇和异欧前胡素的进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，羌活醇进样量在0.025 2～0.126 0 mg范围内线性关系良好，回归方程为＝1.034 0×107－1.614 1×104（＝1.000 0）；异欧前胡素进样量在0.013 1～0.065 6 mg范围内线性关系良好，回归方程为＝1.415 3×107－1.154 1×104（＝1.000 0）。

2.3.2 精密度试验

精密吸取对照品溶液2 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算峰面积RSD，结果羌活醇为0.26%，异欧前胡素为0.29%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取羌活样品（S1）约0.25 g，按“2.2.2”项下方法制备，精密吸取供试品溶液2 μL，分别在0、2、4、8、12、18、24 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定，计算峰面积RSD，结果羌活醇为0.58%，异欧前胡素为0.38%，表明供试品在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验

分别称取6份同一羌活样品（S1）各约0.25 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件，每份平行测定2次，计算得供试品溶液中羌活醇含量RSD＝2.29%，异欧前胡素含量RSD＝2.35%，结果表明方法的重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验

分别称取9份同一羌活样品（S1）各约0.125 g，精密称定，分别按样品中目标成分含量的50%、100%、150%加入羌活醇和异欧前胡素对照品，每个水平平行3份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件，每份平行测定2次，分别计算羌活醇、异欧前胡素的回收率，结果平均回收率分别为99.85%、101.41%，RSD分别为1.31%、1.48%，表明方法的准确度良好。

2.3.6 含量测定

称取5批羌活样品和5批宽叶羌活样品各2份，每份0.25 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样2次，计算羌活醇和异欧前胡素的含量。结果羌活中羌活醇和异欧前胡素的平均含量分别为4.61、4.12 mg/g，宽叶羌活中羌活醇和异欧前胡素的平均含量分别为0.13、11.44 mg/g。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 方法学考察

2.4.1.1 精密度试验

取羌活供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以14号异欧前胡素色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间RSD均小于0.24%，相对峰面积RSD均小于2.18%，表明仪器精密度良好。

2.4.1.2 稳定性试验

取羌活供试品溶液（S1），在室温避光环境下放置0、2、4、8、12、18、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以14号异欧前胡素色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.51%，相对峰面积的RSD均小于2.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.1.3 重复性试验

取羌活样品（S1）0.25 g，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以14号异欧前胡素色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间RSD均小于0.20%，相对峰面积RSD均小于2.59%，表明方法的重复性良好。

2.4.2 指纹图谱的建立

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对30批羌活样品UPLC图谱进行分析，确定15个共有峰，并指认其中2个成分，分别为羌活醇（峰13）和异欧前胡素（峰14）。

2.4.3 相似度评价

将30批羌活样品UPLC图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），设定S6样品为参照图谱，进行指纹匹配，时间窗口设为0.1 min，以中位数法建立30批羌活样品UPLC指纹图谱，结果见图2；设定S6样品为参照图谱，进行指纹匹配，时间窗口设为0.1 min，以中位数法建立羌活（S1～S15）UPLC指纹图谱，结果见图3；设定S16样品为参照图谱，进行指纹匹配，时间窗口设为0.1 min，以中位数法建立宽叶羌活样品（S16～S30）UPLC指纹图谱，结果见图4。分别对30批羌活样品及不同基源羌活样品指纹图谱进行相似度评价，结果见表2～表4。结果表明，30批不同基源的羌活样品差异较大，相似度为0.359～0.986；同基源的羌活样品差异不大，羌活相似度为0.719～0.981，宽叶羌活为0.985～0.999。

图2 30批羌活样品UPLC叠加图及对照图谱

图3 15批羌活样品（S1～S15）UPLC叠加图及对照图谱

图4 15批宽叶羌活样品（S16～S30）UPLC叠加图及对照图谱

表2 30批羌活样品相似度评价结果

编号相似度编号相似度编号相似度 S10.477 S110.798 S210.986 S20.359 S120.806 S220.975 S30.436 S130.740 S230.985 S40.393 S140.727 S240.976 S50.502 S150.778 S250.975 S60.752 S160.980 S260.983 S70.762 S170.972 S270.977 S80.790 S180.972 S280.982 S90.784 S190.980 S290.981 S100.805 S200.976 S300.972

表3 15批羌活样品（S1～S15）相似度评价结果

编号相似度编号相似度编号相似度 S10.879 S60.975 S110.939 S20.719 S70.963 S120.964 S30.779 S80.960 S130.981 S40.790 S90.958 S140.977 S50.895 S100.949 S150.975

表4 15批宽叶羌活样品（S16～S30）相似度评价结果

编号相似度编号相似度编号相似度 S160.998 S210.995 S260.997 S170.996 S220.992 S270.998 S180.994 S230.985 S280.999 S190.994 S240.999 S290.999 S200.996 S250.998 S300.993

2.5 化学模式识别

2.5.1 聚类分析

以各共有峰的峰面积作为变量，导入SPSS20.0统计软件，采用组间连接法，以Euclidean距离作为度量标准，进行聚类分析，结果见图5。当距离为15时，30批羌活样品可聚为两类，其中15批羌活样品（S1～S15）聚为一类，15批宽叶羌活样品（S16～S30）聚为一类。

图5 30批羌活样品聚类分析图

2.5.2 主成分分析

以30批羌活样品的共有峰面积为变量，导入SIMCA-P+13.0（Demo）软件，采用非监督模式识别方法PCA进行分析，结果见图6。30批羌活样品可分为2组，S1～S15为一组，S16～S30为一组，与聚类分析结果一致。

图6 30批羌活样品PCA得分图

2.5.3 正交偏最小二乘-判别分析

为更好分析不同基源羌活样品的组间差异，采用OPLS-DA对30批羌活样品进行分析，OPLS-DA得分图见图7。由于不同基源羌活在组成成分上存在一定差异，为进一步说明各共有峰变量差异的大小，采用OPLS-DA对15个共有峰的峰面积数据进行分析，并结合差异性标志物的变量重要性投影（VIP），筛选导致羌活组分差异较大的成分，OPLS-DA载荷图见图8，差异性标志物VIP见图9。以VIP＞1.0作为标准，筛选出对不同基源羌活分组具有关键作用的前9个变量，其影响从大到小依次为峰8、峰12、峰14（异欧前胡素）、峰13（羌活醇）、峰9、峰3、峰6、峰10、峰11。

图7 30批羌活样品OPLS-DA得分图

图8 30批羌活样品指纹图谱共有峰OPLS-DA载荷图

图9 30批羌活样品差异性标志物VIP

3 讨论

本试验采用二极管阵列检测器，分别在波长230、246、310 nm处对供试品进行扫描，结果在波长246 nm处有较大吸收且基线相对平稳，故选择246 nm作为检测波长；通过对不同流动相体系及流动相梯度进行考察，优选出分离效果最佳筛网流动相体系及梯度；考察了不同柱温对分离效果的影响，优选出分离效果最佳的柱温。

本研究采用UPLC对不同基源羌活药材进行含量测定及指纹图谱综合性评价，结果同一基源不同产地羌活药材质量相似、指纹图谱相似度较高，而不同基源羌活药材质量差异较大、指纹图谱相似度较低，结合化学模式识别技术对不同基源羌活药材进行深入探索，可快速发现2种基源药材之间的差异，为不同基源药材的鉴别和分析提供准确、可靠的方法。

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Study on Determination of Different Base Sources of Notopterygii Rhizoma et Radix and Combination of Fingerprint and Chemical Pattern Recognition

WANG Qian1, WANG Xiang1,2,3, YANG Mengting1, WANG Xinguo1,2,3, NIU Liying1,2,3

To establish UPLC content determination and fingerprint analysis method for different base sources of Notopterygii Rhizoma et Radix; To provide a basis for its quality evaluation.ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm) was used; acetonitrile- 0.1% phosphoric acid solution was set as mobile phase, with gradient elution; flow rate was 0.3 mL/min; detection wavelength was 246 nm; column temperature was 35 ℃; injection volume was 2 μL. According to the content determination and fingerprint results, the quality of 30 batches of Notopterygii Rhizoma et Radix samples was evaluated by similarity evaluation, cluster analysis, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA).The notopterol and isoimperatorin were well separated under these conditions, and had a wide linear range and a good linear relationship (=1.000 0). The average recovery rates were 99.85% and 101.41%. RSD was 1.31% and 1.48%. The fingerprint had good separation effect under this condition; the peak time was moderate; the number of peaks was large; the baseline was stable; the method was stable. 15 common peaks were selected and two components were identified. The similarity of samples ofTing ex H. T. Chang andH. de Boiss were 0.719–0.981 and 0.985–0.999 respectively. The cluster analysis, PCA and OPLS-DA showed that 30 batches of Notopterygii Rhizoma et Radix samples were clustered into 2 types and screened out 10 components with large differences in the composition including notopterol and isoimperatorin.The methods established can quickly identify and evaluate the source and quality of Notopterygii Rhizoma et Radix, and provide reference for the internal quality control of Notopterygii Rhizoma et Radix.

Notopterygii Rhizoma et Radix; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares discriminant analysis