豨莶草对胶原诱导性大鼠关节炎的治疗作用

贾永利 杨新明 张培楠 孟宪勇 胡长波 阴彦林

河北北方学院附属第一医院骨外科，河北 张家口 075000

类风湿关节炎是以滑膜炎为特征的慢性系统性疾病，随着疾病的加重，可破坏关节软骨、关节囊，导致关节畸形和丧失功能[1]。目前治疗类风湿关节炎以减少患者活动从而控制关节损伤、防止功能丧失，达到缓解疾病目的，但现实生活中很多患者无法做到减少活动[2]，导致治疗受到影响。豨莶草具有祛风除湿、清热解毒、抗炎镇痛等功效，在临床上应用于关节疼痛、急性肠炎等治疗，可缓解关节炎中炎症因子水平，从而抑制疾病发展[3]，但具体机制尚不清楚。白细胞介素(interleukin，IL)-23/辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)介导的B细胞促炎性机制与关节炎关系密切，对类风湿关节炎的发生、发展至关重要[4]。但尚未发现豨莶草与IL-23/Th17的相关研究，推测豨莶草可能通过IL-23/Th17炎症轴影响类风湿关节炎。因此，本研究拟通过建立胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，采用豨莶草灌胃，探讨豨莶草对CIA治疗的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：40只雄性SD大鼠均购自山东大学实验动物中心，SPF级，6周龄，体重(205±10)g，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0001，动物使用许可证号：SYXK(鲁)2019-0005，动物质量合格证号：NOD2019061327。所有大鼠均在河北北方学院附属第一医院动物实验室饲养，在温度23 ℃～25 ℃、湿度50 %的环境中自由饮水、摄食暂养1周后，开始实验。本研究经河北北方学院附属第一医院伦理委员会审核并通过，伦理审批号：2020-101479。实验严格遵守3R原则。

1.1.2主要药物、试剂与仪器：牛Ⅱ型胶原购自美国Chondrex公司，批号：20021；冰醋酸、弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司，批号：L2880、F5881；豨莶草来自本院中药房；IL-23重组质粒由艾美捷科技有限公司合成；苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)试剂盒购自北京索莱宝公司，批号：G1120；大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自英国abcam公司，批号：ab119545、ab204522、ab222503、ab223857、ab100707；抗CD3-PE、抗CD8-FITC、PE-IL-17、PE-IgG1购自美国eBioscience公司，批号：22-0308-72、25-5273-42、210-17、25-4888-82；总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，批号：DP477；cDNA第一条链合成试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司，批号：11102-C；荧光定量PCR试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，批号：BTN12-284。DMM-400C型显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司；Attune NxT型流式细胞仪、ProFlex?型实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)仪均购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型制备：将牛Ⅱ型胶原提前用冰醋酸溶解，4 ℃保存过夜备用。将豨莶草提前在40 ℃烘干后碾碎成粉，经3号筛过滤后加入10倍水，在80 ℃水中浸泡30 min，提取2次，过滤后弃去滤渣，留滤液浓缩至100 mL，放置室温后,2 000 r/min离心10 min，取上清液，质量浓度调整为250 g/L备用。IL-23重组质粒经过纯化并鉴定。将30只大鼠根据参考文献[5]建立CIA模型，弗氏完全佐剂：牛Ⅱ型胶原溶液=1∶1，在冰浴中充分乳化，配置成混合液，腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，在大鼠(右后趾、尾、背)部多点注射混合液，每只注射0.3 mL。另外10只大鼠作为阴性对照组，在相同部位注射等体积生理盐水，14 d后进行相同操作，再二次免疫3～7 d，模型大鼠足趾肿胀明显，关节炎指数明显增加，即为模型成功。模型成功后的大鼠按随机数表法分为模型组、豨莶草组、豨莶草+IL-23组，每组10只。豨莶草组给予灌胃2 g/kg豨莶草提取物[6]，1次/d，连续灌胃7 d；豨莶草+IL-23组在给予灌胃2 g/kg豨莶草提取物的同时，经尾静脉注射IL-23重组质粒，只在灌胃豨莶草提取物第1天时经尾静脉注射IL-23重组质粒一次，豨莶草提取物灌胃1次/d，连续7 d；阴性对照组、模型组均灌胃等体积的生理盐水和经尾静脉注射相同体积生理盐水。

1.2.2样本收集：实验结束后观察大鼠形态并称量体质量，检测大鼠足趾肿胀度、关节炎指数，经腹主动脉采血后，立即处死大鼠，取滑膜组织，部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，部分置于- 80 ℃冰箱中保存。

1.2.3大鼠足趾肿胀度、关节炎指数测定：运用水容积法测定大鼠左后足的容积，即足趾肿胀度。大鼠关节炎指数采用5级评分法[7]，根据关节红肿、肿胀情况评定，0分：无红肿、无异常；1分：趾关节红肿；2分：趾关节和足趾肿胀；3分：踝关节以下均肿胀但不变形；4分：踝关节及以下肿胀明显，关节变形严重。大鼠所有关节炎指数之和即为每只大鼠关节炎指数。

1.2.4HE染色检测滑膜组织形态学情况：滑膜组织经多聚甲醛固定过夜后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋，切片(厚度6 μm)。石蜡切片在90 ℃中烘箱中烘30 min，经二甲苯脱蜡后放入乙醇中脱水，蒸馏水中洗涤，将蒸馏水洗涤过的切片移入苏木精液中5～10 min，细胞核染色，自来水洗去切片上残余染液，将切片放入1 %盐酸乙醇液中褪色，切片变红、颜色变浅即可，3～10 s，1 %氨水中反蓝，蒸馏水浸片，经0.5 %伊红酒精溶液染色2～5 min、细胞质染色，乙醇脱水、二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察并拍照保存。

1.2.5ELISA检测大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量：将大鼠腹主动脉血以3 000 r/min离心10 min，收集血清；滑膜组织加入9倍体积的等渗盐水碾碎后以10 000 r/min离心20 min收集上清，96孔板包被缓冲液稀释过的大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21抗体、4 ℃过夜，倒掉包被液，缓冲液清洗；通过样品稀释液稀释IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21标准品和样品，每孔加100 μL标准品或样品，室温孵育2 h，洗板，每孔加入HRP标记过的稀释过的IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21单克隆抗体100 μL、室温孵育1 h，洗板，每孔加样品稀释液稀释过的酶、室温孵育1.5 h，洗板，每孔加100 μL反应底物、室温避光反应30 min，每孔加50 μL反应终止液，450 nm处测定吸光值。根据标准品绘制标准曲线，计算待检样品浓度。

1.2.6流式细胞术检测Th17细胞百分比：将2 mL腹主动脉血经肝素钠抗凝后，通过密度梯度离心法分离单个核细胞；将滑膜组织剪碎，用RPMI-1640培养液将滑膜组织制成悬液，均将细胞密度调整为1×106个/mL。加入刺激剂后，加入抗CD3-PE、抗CD8-FITC，溶血，破膜通透，加入PE-IL-17及同型对照PE-IgG1，流式细胞仪检测Th17细胞百分比。

1.2.7RT-qPCR检测IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平：将腹主动脉血、滑膜组织分别提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒反转录成cDNA，β-actin作为内参基因，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列见表1。RT-qPCR上样体系20 μL，包括cDNA(50 ng/μL)1 μL、正向引物/反向引物(均为10 μmol/L)0.5 μL /0.5 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL；反应条件包括94 ℃、60 s；95 ℃、30 s(IL-23 58 ℃ 30 s、IL-17 58 ℃ 30 s、IL-6 56 ℃ 40 s、IL-22 61 ℃ 35 s、IL-21 59 ℃ 40 s)，40个循环。通过2-ΔΔCt法计算IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21相对表达水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 四组大鼠体质量比较

模型组大鼠出现食欲不振、困倦症状；豨莶草组大鼠上述症状有所缓解。与阴性对照组[(347.45±15.49)g]相比，模型组[(275.95±14.51)g]大鼠体质量降低(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组[(315.44±22.19)g]大鼠体质量升高(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组[(286.18±21.47)g]大鼠体质量降低(P<0.05)。

2.2 四组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数的比较

造模成功率为100%。与阴性对照组相比，模型组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数升高(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数降低(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数升高(P<0.05)。见表2。

表2 四组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数的比较

2.3 四组大鼠滑膜组织形态学情况

阴性对照组滑膜细胞排列整齐、疏松，滑膜细胞间胶原间质明显，无炎症浸润现象；模型组细胞排列紊乱、无规律可循，炎症现象明显，成纤维细胞增生明显，可观察到炎症、纤维蛋白渗出物；豨莶草组滑膜细胞重新出现胶原间质，炎症现象明显减少；豨莶草+IL-23组相较于豨莶草组有炎症细胞增多趋势。见图1。

图1 四组大鼠滑膜组织形态学情况(标尺：200 μm)Fig.1 Histomorphology of synovial membrane of rats in 4 groups (scale: 200 μm)

2.4 四组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比比较

与阴性对照组相比，模型组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比升高(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比降低(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比升高(P<0.05)。见表3。

表3 四组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比比较

2.5 四组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比比较

与阴性对照组相比，模型组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比升高(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比降低(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比升高(P<0.05)。见表4。

2.6 四组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比较

与阴性对照组相比，模型组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。见表5。

表4 四组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17细胞百分比比较

表5 四组大鼠腹主动脉血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比较

2.7 四组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比较

与阴性对照组相比，模型组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；与模型组相比，豨莶草组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；与豨莶草组相比，豨莶草+IL-23组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。见表6。

表6 四组大鼠滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比较

3 讨论

类风湿关节炎属自身免疫疾病，病理表现为滑膜炎，炎症刺激可导致骨质吸收和骨形成平衡被打破，从而导致骨和软骨被破坏，大量炎症细胞因子参与骨质丢失过程[8]。在CIA模型中关节肿胀、滑膜组织增生、部分组织缺氧、炎症细胞浸润、成纤维细胞样滑膜细胞异常增生导致软骨侵蚀、骨骼破坏现象[9]。本研究发现，模型组大鼠出现食欲不振、困倦症状，且大鼠体质量下降，提示CIA影响大鼠食欲、体重、精神状态；足趾肿胀度、关节炎指数升高，提示大鼠足趾、关节炎症严重，从而导致疾病发生；进一步HE染色发现滑膜组织中细胞排列紊乱、炎症现象明显，成纤维细胞增生明显，可观察到炎症、纤维蛋白渗出物，提示大量炎症现象导致骨和软骨破坏、骨质丢失，成纤维细胞增生明显导致滑膜增生与凋亡失衡，细胞因子失衡导致病变持续进展。在治疗上西医采用抗炎镇痛、关节内注射玻璃透明质酸或糖皮质激素、全关节置换术等，但近期及远期疗效欠佳，未能从根本上缓解疾病。而中医在类风湿关节炎中的治疗表现出了优势[10]。

类风湿关节炎属中医痹症范畴，《素问·痹论》云：“黄帝问曰：痹症安生？岐伯对曰：风寒湿三气杂至，合而成痹也”，且古代医者认为外邪侵袭、三焦阻滞，肺腑亏虚、三焦气化失常，湿气均为类风湿关节炎的主要机制，因此治疗上以汗而发之，利其小便，温阳化气、调补肾脾肺[11]。豨莶草性味归经，归肝、肾经，具有行痹止痛、郁而化热之功效[12]，在临床上能够降低活性氧和抑制氧化应激从而减轻炎症通路表达，通过抗氧化、抗炎作用用于治疗类风湿关节炎[13]。本研究发现，与模型组相比，豨莶草组食欲不振、困倦有所缓解、体质量升高，足趾肿胀度、关节炎指数下降，滑膜组织中炎症浸润现象、成纤维细胞增生现象得以缓解，提示豨莶草可能通过减轻炎症现象、缓解成纤维细胞增生现象从而行痹止痛、郁而化热，达到缓解足趾肿胀、关节炎症状，从而达到治疗疾病目的。

IL-6、IL-23可刺激T细胞上特定结合受体，诱导CD4+T细胞分化为高致病性的Th17[14]。Th17作为辅助T细胞，可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子，在自身免疫疾病发生中起重要作用[15]。其中IL-17作为T细胞诱导的最早启动因子，可促进前炎性因子的释放进而诱导炎症因子水平增加，可介导中性粒细胞诱发滑膜炎症反应[16]；而刺激IL-17表达后又可影响多条信号通路促进T细胞和上皮细胞激活，从而产生更多的IL-6、IL-23等炎症因子[17]。在类风湿关节炎中IL-23、IL-17、IL-6、IL-1、IL-33水平升高，且与疾病严重程度、临床症状评分关系密切，可将炎症因子作为诊断、评估疾病和治疗的标志[18]。本研究发现，与阴性对照组相比，模型组腹主动脉血、滑膜组织中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量和mRNA水平以及Th17百分比均升高，提示在CIA血液和滑膜组织中机体处于紊乱状态，IL-6、IL-23处于激活状态可刺激Th17分化，促进IL-17分泌，而IL17作为前促炎因子促进促炎因子IL-22、IL-21等释放；同时IL-17亦可促进IL-6、IL-23的分泌，从而促进IL-23/Th17过程，级联放大促进滑膜组织炎症，加速疾病进程。与模型组相比，豨莶草可抑制IL-23/Th17过程，从而减轻炎症反应，实现对疾病的缓解。而在豨莶草基础上添加IL-23重组质粒可逆转豨莶草对疾病的缓解作用，提示豨莶草在类风湿关节炎中是通过抑制IL-23/Th17炎症轴进而缓解疾病。

综上所述，豨莶草可通过抑制IL-23/Th17炎症轴从而抑制炎症反应，起到对类风湿关节炎的治疗作用。但中药豨莶草成分复杂，亦可能通过其他信号通路发挥作用，对于这方面有待开展进一步的研究、探索。