淫羊藿苷与雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

高巳东 邓洋洋 王重一 林浩楠 林庶茹

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症[1](postmenopausal osteoporosis，PMOP)属于Ⅰ型原发性骨质疏松症。PMOP好发于绝经后5～10年之间[2]，是由于骨吸收与骨生成之间平衡受到破坏，成骨因子合成量减少，骨矿含量低下，导致骨密度下降[3-4]。

淫羊藿入肝、肾经，为补肾阳、强筋骨、祛风湿之要药。《中国药典》标注，淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿中含量最高的单体[5]，其含量至少为0.5 %[6]。分子式呈植物雌激素样结构[7]。因ICA疗效明显，易获取，且基于雌激素-ERα轴探讨应用植物雌激素ICA与激素替代疗法对比的相关研究较少，遂选择ICA进行本次实验。本研究将对比补肾填精中药单体ICA与雌激素替代疗法促进BMSCs向成骨分化及对内环境雌激素(estrogen，E2)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料：SD大鼠BMSCs(冻存代次P2)购自赛业(苏州)。

1.1.2主要实验试剂：SD大鼠骨髓间充质干细胞培养液、茜素红(赛业，中国)；雌二醇、淫羊藿苷(上海源叶，中国)；大鼠ALP、E2 ELISA试剂盒(联硕生物，中国)；罗丹明标记鬼笔环肽(索莱宝，美国)；ERα抗体(三鹰，中国)；FITC标记山羊抗兔IgG(EARTHOX，美国)。

1.1.3主要实验仪器：IX71 型倒置相差显微镜(Olympus，日本)；CO2培养箱(Thermo，美国)；Infinite M200 型多功能酶标仪(TECAN，奥地利)；BL610/BL1500 电子天平(赛多利斯，中国)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养：将大鼠BMSCs接种于含体积分数为10 %胎牛血清的培养基中，置于37 ℃、5 % CO2培养箱内静止培养。观察细胞生长至对数时期时，进行传代培养。本次实验选取第3、4代。将细胞分为正常组、E2组、ICA组和E2+ICA组。

1.2.2MTT法检测细胞增殖：根据前期实验积累，将总质量20 mg、分子量为676.65的ICA溶解于DMSO中，配制浓度为10-6mmol/L。将总质量100 mg、分子量为272.382的17β-E2溶解于DMSO中，配制浓度为10-8mmol/L。将消化后的细胞反复吹打混匀，以5×108/孔为标准，均匀铺满96孔板。培养24 h，将原有培养液吸走，再加入培养液(含体积分数为0.5 %胎牛血清)继续培养24 h。将原有培养液吸走，加入含药培养液，设置正常组、E2、ICA组、E2+ICA组，共计4组，每组6个复孔，干预24、48、72 h。然后，按照试剂盒说明书加入MTT溶液，培养1 h。将96孔板放入酶标仪中，用570 nm波长检测吸光度。

1.2.3茜素红染色：将BMSCs反复吹打混匀，用24孔板设置细胞为 5×104个/孔均匀铺板，每组4个复孔，分别培养6、12、18 d。观察细胞状态后弃培养液，用PBS洗涤细胞两次，多聚甲醛浸泡30 min固定形态，再用PBS清洗两次，滴入茜素红染液避光染色30 min，置于37 ℃、CO2培养箱内静置。染色后用PBS冲洗2次。待表面水汽蒸发完全后，镜下观察视野内矿化结节。

1.2.4ELISA法检测ALP[8]、E2[9]活性：取各组细胞上清液，置于- 80 ℃保存；运用ELISA试剂盒对ALP、E2检测，标准曲线制备及样品测定方法按照说明说操作。在490 nm的波长处检测OD值，根据标准曲线计算各孔浓度。

1.2.5ERα免疫荧光染色：在24孔板中，每孔放入枚爬片，再设置BMSCs为5×104个/孔均匀铺板,每组4个复孔，分别培养6、12、18 d。爬片用 PBS 洗涤两次，在室温下用4 %多聚甲醛固定15 min，将细胞与ERα抗体(1∶200)一起孵育过夜。与FITC标记山羊抗兔IgG (1∶500) 孵育2 h，加罗丹明标记鬼笔环肽对细胞骨架染色，DAPI复染细胞核。用激光扫描共聚焦显微镜观察染色的ERα。细胞中ERα的表达量用ImageJV1.8.0.112软件进行分析统计。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖功能

将各组细胞分别培养24、48、72 h，E2组和ICA组的OD值在48 h时到达峰值，随后降低；E2+ICA组在72 h时到达峰值，但该组48 h与72 h相差不明显；细胞增殖24 h时，E2组增殖量高于ICA组，48、72 h的结果显示ICA组增殖量高于E2组，且在48 h时ICA组高于E2+ICA组，见图1。

图1 MTT增殖与活力检测表Fig.1 The MTT proliferation and viability detection table 注：与正常组同一时间比较，**P<0.01；与组内不同时间比较：与24 h组比较，○○P<0.01；与48 h组比较，△P<0.05。

2.2 ELISA法检测ALP、E2

2.2.1ALP活性检测：检测各组在6、12、18 d 时的ALP活性，随着培养时间延长而发生变化，相同时间点各给药组ALP活性从小到大依次为ICA组

2.2.2E2活性检测：根据ALP结果，检测各组在 12 d 时E2活性，各给药组E2活性从低到高依次为：正常组

表1 不同时间各组ALP活性比较

表2 各组细胞E2活性比较

2.2.3茜素红染色结果：BMSCs诱导12 d，经茜素红染色后光镜下观察矿化结节(+)，大小不等，分布不均，各组矿化结节数量有所不同(图2)。各给药组矿化结节数量均多于正常组(A)，数量从少到多，依次为ICA组(C)< E2组(B)< E2+ICA组(D)。与ALP活性结果趋势一致。

图2 各组茜素红染色结果Fig.2 Results of alizarin-red staining in each group注：A：正常组；B：E2组；C：ICA组；D：E2+ICA组。

2.2.4ERα免疫荧光染色：通过免疫荧光技术[10]对细胞骨架(红色)、ERα(绿色)和细胞核(蓝色)进行染色，观测正常组、E2组、ICA组和E2+ICA组的ERα表达量及其亚细胞的定位改变(图3、图4)。结果显示，ERα在成骨细胞中主要分布于细胞质内，与正常组相比，各给药组细胞核内ERα的分布增多，核内的基因转录随之增加。数量从少到多，依次为ICA组

图3 免疫荧光染色法检测ERαFig.3 Immunofluorescence staining method to detect ERα

图4 各组ERα平均荧光强度Fig.4 Average fluorescence intensity of ERα注：与正常组比较，**P<0.01；与E2组比较，○P<0.05，○○P<0.01；与ICA组比较，△△P<0.01。

3 讨论

3.1 “肾精”“内环境雌激素水平”与PMOP的关系

近代研究[11]表明，PMOP诱因除年龄因素外，雌激素缺乏、ER相关蛋白表达水平下降在PMOP发病机制中至关重要。雌激素与维生素 D、钙及其他激素一起，在体内进行有效地分解并参与骨重建。其中，雌激素的骨保护作用主要由雌激素受体α介导[12]。在雌性小鼠中，雌激素-ERα轴的激活对于皮质骨和小梁骨的扩张、成骨细胞成熟至关重要[10,13-14]。

《黄帝内经》提到“二七天癸至，...，月事以时下”“女子七七，...，天癸竭，地道不通”，天癸与女子月事息息相关，也可反映肾中精气盛衰。肾精充，天癸至，女子初潮；肾精衰，天癸竭，女子绝经。PMOP可引起骨质、骨量及骨功能的异常。中医将“肾、骨、髓”组成了一个相互关联的系统。其根本在于肾，以肾藏精，灌输、濡润、滋养骨腔脑髓。骨作为“靶器官”，与肾中精气关系密切。维系肾与骨之间的中间精微物质则是髓液，为肾精所化生。PMOP的发生与中医肾精亏虚，雌激素异常相关。

3.2 雌激素替代疗法与植物激素应用的比较

众所周知，绝经后妇女雌激素缺乏会导致PMOP的发生。研究[3,15]表明，雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy , ERT)能够治疗因雌激素水平缺乏引起的PMOP相关症状，但ERT同时也存在弊端，如造成肥胖、高血糖，甚至引起乳腺癌、心血管疾病及血栓等严重副作用。与ERT相比[16]，植物雌激素或植物来源的异种雌激素同样具有缓解PMOP相关症状的功能。植物雌激素最大的优点在于通过双向调节以维持雌激素含量升降平衡，具有更安全、高效、全面的特性。

3.3 ICA对内环境雌激素水平、ALP的影响

补肾填精中药单体ICA属于植物雌激素，可促进BMSCs向成骨分化[11]。ICA的药效反应更快、毒性更小、短期药效水平维持良好，本研究仅进行单药最佳浓度1∶1配合应用，也为后续探讨根据药物反应时效调整不同时间段的用药比例以发挥最佳药效提供了实验基础。ALP是成骨细胞的一种早期特征性生物标志物[17]，可进一步促进成骨细胞矿化。对比各给药组E2活性与ALP活性趋势，尽管单纯补充雌激素疗法可以更显著地提高细胞内雌激素含量，但ICA在促进BMSCs向成骨分化以防治骨质疏松症的同时，又能将内环境雌激素的含量趋于正常标准，以此规避ERT的副作用，效果良好。

综上所述，根据中医理论“肾藏精主骨”，肾精充足，骨骼强健，补肾填精中药单体ICA可以通过提高ERα核内表达，增加ALP含量，维持正常雌激素水平。能够用于治疗雌激素缺乏为主的PMOP，亦可为绝经后雌激素分泌异常导致的其他慢性病提供新靶点和新思路。