运动抑制Fis1/Bap31信号通路蛋白表达减少海马神经元凋亡并改善抑郁大鼠活力

钱博文，钟志廷，刘春艳，王 皓

[武汉钢铁(集团)公司第二职工医院 精神心理科，湖北 武汉 430080]

抑郁症是一类常见的精神疾病，在各大城市人群中呈高发和逐年递增趋势[1]。研究显示，神经元凋亡可能是抑郁症所有发病机制最终结果[2]。运动作为促进机体心理健康的刺激因素，在维持或代偿受损神经元凋亡方面的作用已被诸多研究证实[3-4]。相反，不可预知的心理和生理应激都会造成海马神经元的凋亡[5]。然而，运动如何抑制神经元凋亡，改善动物抑郁样行为的机制尚不明确。

Fission protein 1(Fis1)定位于线粒体外膜，B-cell receptor-associated protein 31(Bap31)定位于内质网膜，两者参与细胞凋亡和细胞自噬诱导抑郁症的发生[6]。Fis1被证实可与Bap31形成复合物，该复合物募集并活化Caspase-8，导致内质网过量释放Ca2+。线粒体中出现钙超载并激活Bax、Bid蛋白，促进CytC释放，造成神经元凋亡[7-8]。Chen等[9]研究显示，糖尿病大鼠因血糖增加诱导的细胞死亡与线粒体的融合及裂解相关，其中Fis1表达增多会导致大鼠出现抑郁样症状。因此，Fis1/Bap31信号通路介导的神经元凋亡与抑郁症相关，但运动改善生物抑郁样行为是否与Fis1/Bap31信号通路相关尚未有探索。本研究拟采用慢性温和不可预测性应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)/孤养构建大鼠抑郁样行为模型，探究运动对抑郁样行为大鼠的影响是否与Fis1/Bap31信号通路相关。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 48只7周龄雄性健康SD大鼠，体质量230～250 g，由武汉大学动物实验中心提供，生产许可证：SCXK(鄂)2019-0004，动物合格证号：201909125。大鼠随机分为对照组、CUMS组、运动+CUMS组、运动+CUMS+运动组，每组12只。正常饲养环境(非造模期间)：正常日夜节律、自由饮食摄取、背景噪音为(40±10)dB、温度为(24±2)℃、湿度为60%～70%。

1.2 实验仪器与材料 强迫游泳仪器(型号ZS-QPT)、旷场实验行为学仪器(型号：ZS-KC)及分析软件(北京众实迪创科技公司)；Fis1抗体(货号ab156865，美国abcam公司)；Bap31抗体(货号4043S，美国CST公司)；Caspase-3抗体(货号66470-2-Ig)、Caspase-8抗体(货号13423-1-AP)、Bcl-2抗体(货号12789-1-AP)、Bax抗体(货号50599-2-Ig)、β-actin抗体(货号66009-1-Ig)(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.3 实验设计 实验前10周，所有动物正常饲养，但运动+CUMS组、运动+CUMS+运动组每日游泳锻炼。后3周，对照组动物正常饲养，其余各组大鼠分笼饲养，每笼1只，此外，CUMS组、运动+CUMS组、运动+CUMS+运动组大鼠接受每天2次的应激刺激[10]。应激刺激期间运动+CUMS组停止游泳锻炼，运动+CUMS+运动组在慢性应激期间持续游泳锻炼。

应激刺激计划：刺激方式有电击足底、冰水游泳、潮湿垫料、夹尾、禁水、禁食、昼夜颠倒、拥挤、噪音等。各种刺激以抽签形式随机抽取，2次/天，3 d内不重复，持续21 d。

游泳锻炼计划：第1～2周20分钟/次，第3～4周30分钟/次，第5～13周40分钟/次。所有计划均为1次/天，6天/周。

1.4 行为学测试 糖水偏好实验：大鼠单笼饲养，禁食禁水24 h后，给予一瓶白水、一瓶1%蔗糖水，称量每只动物12 h内饮用白水与蔗糖水的质量，计算糖水摄取率。本实验开展2次，分别为第10周训练和第13周应激结束。

旷场实验：80 cm×80 cm×40 cm规格旷场实验箱，箱底以白线划分为25块面积相等的正方形。将动物放入正中央格开始测试，3分钟/次，以分析软件计算大鼠穿越箱底方块次数。

强迫游泳实验：直径为80 cm，高120 cm的圆形桶，桶中注入温水。将大鼠投入，3分钟/次，以软件分析大鼠3 s内在同一位置停留不动的时间累积，记为不动时间。

1.5 Nissl染色 大鼠麻醉，以生理盐水心脏灌流。待血液冲洗干净后，断头取脑，保存于3%多聚甲醛之中。4℃过夜后以梯度乙醇脱水，以石蜡包埋组织并切成4 μm切片，根据Nissl试剂盒说明书染色，封胶后在光学显微镜下观察拍片。

1.6 Western blot实验 分离出大鼠海马组织，加入裂解液裂解组织并匀浆，离心取上清，加入上样缓冲液，沸水浴使蛋白变性。以蛋白量10 μg上样，开始凝胶电泳，电泳条件为：55 V 30 min，100 V 90 min，以marker到达凝胶底部为终点。电泳后PVDF经转膜、封闭2 h后，孵育一抗稀释液。次日以二抗稀释液室温孵育1 h，滴加发光液，显影仪成像。

2 结果

2.1 运动对CUMS/孤养大鼠抑郁样行为的影响 4组应激前糖水摄取率差异均无统计学意义(P>0.05)。应激后，CUMS组糖水摄取率低于对照组(P<0.05)；而运动+CUMS组和运动+CUMS+运动组糖水摄取率均高于CUMS组(P<0.05)(见表1)。与对照组相比，CUMS组大鼠旷场实验评分降低(P<0.05)，而强迫游泳不动时间延长(P<0.05)；与CUMS组相比，运动+CUMS+运动组大鼠旷场实验评分升高(P<0.05)，而运动+CUMS组和运动+CUMS+运动组强迫游泳不动时间均缩短(P<0.05)(见表2)。

表1 CUMS诱导大鼠糖水摄取率改变(n=12)

表2 CUMS诱导大鼠旷场实验评分与强迫游泳不动时间(n=12)

2.2 运动对CUMS/孤养大鼠海马CA1区神经细胞、Fis1/Bap31信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的影响 Nissl染色结果如图1与表3所示，对照组大鼠海马CA1区神经元密集，细胞之间排列紧密，细胞形态呈球形，破裂较少，尼氏体阳性细胞数较多。与对照组相比，CUMS组大鼠海马神经元排列疏松、体积缩小且尼氏体阳性细胞数降低(P<0.05)，提示应激刺激与孤养造成海马CA1区神经元损伤。与CUMS组相比，运动+CUMS+运动组大鼠海马CA1区尼氏体阳性细胞数增加(P<0.05)，提示持续的运动能够明显改善海马CA1区神经元损伤。

图1 Nissl染色检测运动对慢性应激大鼠海马CA1区神经元的影响

与对照组相比，CUMS组大鼠海马中Fis1蛋白、Bap31蛋白及Caspase-8蛋白表达升高(P<0.05)。与CUMS组相比，运动+CUMS组及运动+CUMS+运动组大鼠海马中Fis1蛋白、Bap31蛋白、Caspase-8蛋白的表达降低(P<0.05)(见图2、表3)。

图2 Western blot检测各组大鼠海马组织中Fis1、Bap31、Caspase-8蛋白表达

与对照组相比，CUMS组大鼠海马组织中Cleaved-Caspase-3蛋白的表达升高(P<0.05)。运动+CUMS组及运动+CUMS+运动组大鼠海马组织中Cleaved-Caspase-3蛋白的表达降低(P<0.05)。此外，与对照组相比，CUMS组大鼠海马组织中Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，Bcl-2/Bax表达比例降低(P<0.05)。运动+CUMS组及运动+CUMS+运动组大鼠大鼠海马组织中Bcl-2/Bax表达比例升高(P<0.05)(见图3、表3)。

图3 Western blot检测各组大鼠海马组织中Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达

3 讨论

本实验以CUMS和孤养方式构建大鼠抑郁样行为模型，其理论是长期刺激积累造成抑郁情绪[11]。大鼠抑郁状态主要为快感缺失、空间探索行为减少、求生反应丧失。这些与临床患者精神运动改变、兴趣丧失症状相似。本研究结果显示大鼠抑郁样行为模型构建成功，持续的运动锻炼能明显改善大鼠抑郁样行为指标，即有陪伴、持续的运动能够预防并改善大鼠抑郁样行为。

Nissl染色显示CUMS组大鼠海马CA1区神经元固缩，分布散乱，即大鼠抑郁样行为与神经元损伤相关[12]。Caspase-3是细胞凋亡过程中关键因子，涉及多种凋亡途径。外源性途径中，跨膜受体与配体结合形成死亡诱导信号复合物，激活Caspsae-8，剪切Caspsae-3，介导细胞凋亡。内源性途径中，应激启动Bax低聚反应，打开线粒体膜，释放Cyt C，与Apaf1结合形成凋亡小体，反过来活化剪切Caspsae-3诱导细胞凋亡[13]。本研究显示，CUMS组中Cleaved-Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表达明显升高，提示神经元损伤与Caspase-3剪切和Caspase-8激活相关。而持续运动都能够明显抑制Cleaved-caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白的表达，减少海马CA1神经元凋亡。

线粒体是持续进行分裂和融合的动态细胞器，线粒体分裂会使线粒体外膜间隙中促凋亡蛋白释放，从而引发细胞的凋亡。Fis1与Bap31是线粒体融合分裂过程中重要的蛋白[14]。Fis1/Bap31信号通路在抑郁症发展中的作用尚未有研究指出，但已有研究分别证实了Fis1、Bap31与细胞凋亡的关系。吴倩等[15]在糖氧剥夺的PC12细胞中，发现细胞凋亡与线粒体分裂蛋白Fis1呈正相关。线粒体分裂抑制剂的干预下，细胞凋亡明显减少。许可等[16]在结直肠癌模型中研究显示miR-451a通过调控Bap31诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。本研究首次提出Fis1/Bap31信号通路促进了大鼠抑郁样行为的发展。CUMS组中Fis1蛋白、Bap31蛋白表达明显升高，即Fis1-Bap31复合物形成增加，造成Caspase-8蛋白活化增加和成海马中神经元的凋亡[17]。而适量运动能够抑制Fis1蛋白的过度表达，减少Caspase-8活化，抑制神经元凋亡。

(致谢：特别感谢武汉大学基础医学院韩城老师在动物实验中给予的指导与帮助。)