HOXB3促进骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移和抑制细胞凋亡的机制研究

罗 凯，段华彬，罗明鼎，宋世杰（雅安市雨城区人民医院骨科，四川雅安 625000）

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨肿瘤，仅次于淋巴瘤和脑癌，是第三大常见癌症[1]。近年研究发现肿瘤的发生发展机制复杂，遗传分子生物学参与其中，为肿瘤的攻克治疗提供了新的研究方向[2]。同源异型盒基因（homeobox genes,HOX）编码的蛋白作为重要的转录因子可调节组织细胞的生长过程，影响细胞增殖分化，与恶性肿瘤的发生发展关系密切[3]。HOXB3 是HOXB基因家族成员，研究报道其在包括结直肠癌在内的人类多个肿瘤中异常高表达，与临床分期及不良预后关系密切，是预测肿瘤预后复发的有效生物学标志物[4-6]，表明其在肿瘤发生发展中扮演着重要角色。细胞分裂周期相关蛋白3（cell division cycle associated protein 3，CDCA3）是一种含有F 盒基序的蛋白质，是细胞有丝分裂的触发因素，研究证实其通过调控有丝分裂过程可调节细胞周期，导致细胞增殖失控，促使恶性肿瘤发生发展[7]；并指出CDCA3 在多种肿瘤中也异常高表达，通过影响细胞周期相关蛋白降解及分子转录，影响G1 周期进展，在介导肿瘤细胞生物学行为中发挥重要作用[7-8]。目前，HOXB3 和CDCA3 在肿瘤发生发展中的作用已被研究证实，然其在骨肉瘤中的作用机制尚不明确，因此本研究拟探究HOXB3 和CDCA3对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及相互调控作用，以期为临床研究提供新的研究分子靶标。

1 材料与方法

1.1 实验对象 收集2020年1月～12月在雅安市第二人民医院骨科行手术治疗的30 例骨肉瘤患者临床组织及其邻近正常组织标本，均由术中获取经病理确认后制成组织标本置于低温液氮中保存备用。人骨肉瘤细胞（U2OS）购于中国科学院上海细胞库，培养在含10 ml/dl 胎牛血清的DMEM 培养基中，并加入青霉素100 IU/ml 和链霉素100 µg/ml，置于95%湿度、5 ml/dl CO2，37℃培养箱中。

1.2 试剂及仪器 DMEM 培养基、链霉素、青霉素购自美国HyClone 公司；脂质体lipo2000，胰蛋白酶购自美国Invitrogen 公司；实时荧光定量PCR 试剂盒、Trizol 试剂、逆转录试剂盒购自美国Promega 公司；PCR 仪、酶标仪购自美国Bio Rad 公司；MTS 反应液、细胞克隆试剂盒、流式细胞仪购自美国Corning 公司；阴性对照siCTL，2 条干扰HOXB3 SiRNA，2 条干扰CDCA3 SiRNA 由北京擎科生物科技有限公司设计、合成等。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染：取生长密度达80%左右的细胞按照Lipo2000 转染试剂盒进行细胞转染，转染2条干扰HOXB3 SiRNA 序列细胞设为siHOXB3#1组和siHOXB3#2 组，转染阴性对照siCTL 序列细胞设为siCTL 组，转染2 条干扰CDCA3 SiRNA 序列细胞设为siCDCA3#1 组和siCDCA3#2 组，转染siHOXB3+ CDCA3 设为共转染组。转染后置于95%湿度，5ml/dl CO2，37 ℃培养箱中常规培养2天，后收集各组细胞用于实验。

1.3.2 实时荧光定量PCR 实验（qRT-PCR）：取转染后各组细胞采用Trizol 试剂盒提取细胞总RNA，经逆转录试剂盒反转录为cDNA，以此为模板配置RCR 反应体系行RT-PCR 扩增；引物HOXB3 F：5’-GCAAUGCUUCGAAGUCUCGUAAG-3’，R：5’-CUAGCAAGACUCGAAGACUUGC-3’；CDCA3 F：5’-AAGACGGTCGGAGTCAGAC-3’，R：5’-CCAGCAGTAGCTGAAGCGG-3’；内参GAP DH F：5’-GCAGCAGATGGCTCGAAAT-3’，R：5’-GCTGTTCTATACTTGTG-3’；反应条件：94℃ 60 s，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，循环40 次；采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达水平。

1.3.3 细胞增殖实验：取消化后各组细胞以1×105个/孔接种于96 孔板，5ml/dl CO2，37 ℃孵育待细胞贴壁后进行转染，每孔设3 个生物复孔；按比例配制MTS 反应液，每孔加入MTS 反应溶液100 μl，继续培养48 h 后检测490 nm 处吸光度（A值），绘制细胞生长曲线。

1.3.4 克隆形成实验：取各组贴壁后细胞进行转染，每孔做3 个生物重复，培养至出现肉眼可见的克隆时终止培养，收集细胞，常温PBS 洗涤两次，用醋酸:甲醇液（1:3）固定15 min，水洗，室温晾干，Giemsa 染色30 min，测量590 nm 处A值。

1.3.5 划痕迁移实验：取消化后各组细胞以1×106个/孔接种于6 孔板，待细胞贴壁后进行转染，待细胞生长至90%时用枪头在孔板中央垂直划痕，PBS 洗一遍，拍照观察各组细胞愈合速率。

1.3.6 细胞凋亡实验：取转染培养后各组细胞于37℃，5l ml/dl CO2条件培养48 h，以1×106个/孔密度接种于6 孔板，预冷PBS 洗涤两次，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书采用试剂盒中膜联蛋白V-FITC/PI 进行染色，流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况，实验重复3 次。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验：取对数生长期各组细胞接种到6 孔培养板，待其生长密度达90%时，将含有海肾荧光素酶报道质粒的野生型CDCA3-WT 和突变型CDCA3-MUT 转染至细胞中，使用双重荧光素酶测定系统（Promega，Beijing，China）测量荧光素酶活性，根据生产商的说明将其转染48 h 后根据海肾荧光素酶活性进行标准化。该测定一式三份进行三个独立的实验。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件进行实验结果分析。数据采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用one-way ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD-t检验；骨肉瘤组织及对应癌旁正常组织中基因表达差异比较采用配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中HOXB3 显著高表达 qRTPCR 检测显示，30 组骨肉瘤组织中HOXB3 表达（41.154±8.626）较邻近正常组织（22.857±7.512）显著升高，差异有统计学意义（t=8.975，P＜0.001）。

2.2 siRNA 转染敲低HOXB3 表达效果验证 qRTPCR 检测显示，相比SiCTL 组（0.971±0.039），转染siHOXB3#1 组（0.325±0.037）和siHOXB3#2组（0.339±0.031）细胞中HOXB3 相对表达水平明显降低，差异有统计学意义（F=318.204，P＜0.001）。提示敲低HOXB3 表达效果转染成功。

2.3 HOXB3 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡的影响 细胞实验检测显示，与SiCTL 组相比，siHOXB3#1 组和siHOXB3#2 组细胞增殖能力、克隆形成率及迁移率明显降低，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。敲低HOXB3 明显抑制了骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成及迁移，促进细胞凋亡。

表1 敲低HOXB3 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡的影响（±s）

表1 敲低HOXB3 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡的影响（±s）

项 目SiCTL 组siHOXB3#1 组siHOXB3#2 组FP细胞增殖A 值0.634±0.0430.413±0.0380.398±0.03037.477＜0.001克隆形成率(%)78.143±1.93229.246±2.82527.911±2.594399.842＜0.001迁移率(%)90.342±5.13635.164±5.43537.617±3.192132.299＜0.001凋亡率(%)6.293±2.01412.556±3.11215.007±2.20110.5560.011

2.4 CDCA3 在骨肉瘤中的表达特征及与HOXB3的相关性 检测显示，30 组骨肉瘤临床组织中CDCA3 表达（38.624±7.736）明显高于邻近正常组织（21.875±6.482），差异有统计学意义（t=9.090，P＜0.001）；骨肉瘤组织中HOXB3 与CDCA3 表达呈正相关（r=0.736，P＜0.01）。

2.5 HOXB3 通过结合CDCA3 启动子区域正向调控CDCA3 表达 经检索数据库发现，HOXB3 与CDCA3 启动子区域存在结合位点，CDCA3 可能是HOXB3 的潜在靶基因。通过构建包含HOXB3 结合位点在内的CDCA3-WT 野生型和CDCA3-MUT突变型质粒，经荧光素酶报告基因实验检测显示，转染siHOXB3 显著抑制了CDCA3 野生型质粒荧光素酶活性（P＜0.05），而对CDCA3 突变型质粒荧光素酶活性无影响（P＞0.05），见表2。证实CDCA3 是HOXB3 的靶基因。经探究HOXB3对CDCA3 表达的影响发现，siHOXB3#1 组（0.374±0.028）和siHOXB3#2 组（0.368±0.031）细胞中CDCA3 表达与SiCTL 组（1.011±0.005）相比明显降低（F=694.283，P＜0.001），说明HOXB3 通过靶向结合CDCA3 启动子区域，正向调控CDCA3 表达。

表2 HOXB3 与CDCA3 靶向结合关系验证（±s）

表2 HOXB3 与CDCA3 靶向结合关系验证（±s）

项 目siCTL 组siHOXB3 组tP WT1.012±0.0060.465±0.02438.298＜0.001 MUT1.010±0.0050.976±0.0192.5020.067

2.6 验证HOXB3 通过调控CDCA3 对骨肉瘤细胞发挥作用 见表3。研究转染CDCA3 干扰序列敲低骨肉瘤细胞中CDCA3 表达，检测发现与siCTL组相比，敲低CDCA3 表达显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖率和克隆形成率（P＜0.05），揭示了CDCA3 的促癌基因属性。在siCDCA3 组细胞中回补CDCA3 后逆转了HOXB3 对细胞增殖、克隆形成、迁移、凋亡的抑制/促进作用，见表4。提示HOXB3 可能通过正向调控CDCA3 表达从而在骨肉瘤中发挥功能。

表3 CDCA3 对骨肉瘤细胞增殖和克隆形成的影响（±s）

表3 CDCA3 对骨肉瘤细胞增殖和克隆形成的影响（±s）

注：与siCTL 组相比，aP＜0.01。

项 目siCTL 组siCDCA3#1 组siCDCA3#2 组FP细胞增殖A 值0.597±0.0410.234±0.035a0.234±0.035a92.731＜0.001细胞克隆形成率（%）97.568±2.57964.623±4.106a60.569±4.217a89.750＜0.001

表4 HOXB3 调控CDCA3 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡的影响（±s）

表4 HOXB3 调控CDCA3 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡的影响（±s）

注：与siCTL 组相比，aP＜0.01。

项 目siCTL 组siHOXB3 组siHOXB3+CDCA3 组FP细胞增殖A 值0.697±0.0410.485±0.028a0.712±0.03043.105＜0.001细胞克隆形成率（%）96.769±3.75952.846±4.327a94.893±4.658101.761＜0.001细胞迁移率（%）88.543±4.52141.769±3.836a86.972±3.768128.675＜0.001细胞凋亡率（%）6.197±2.41314.426±3.057a5.958±2.6389.4560.014

3 讨论

近年，分子生物学研究显示[9]，肿瘤的发生发展是多因素综合作用的结果，表明基因分子生物遗传学参与肿瘤恶变进程，为肿瘤的研究及攻克提供了新的研究方向，也是目前肿瘤学研究的热点话题。HOX 最初是在对果蝇胚胎发育的研究中被发现，其编码一个高度保守的转录因子在胚胎发育过程中起基本作用[10]。发现HOX基因在造血中很重要，因其在不同谱系或不同成熟阶段的造血细胞中特异性表达[11]。目前，人类HOX基因根据序列相似性及在染色体上位置分为HOX A ～D 4 簇，共有39个基因[12]。证实HOX 4 簇基因在多个人类肿瘤中存在异常表达，通过发挥促癌或抑癌基因作用调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为，参与多种人类癌症的发生发展及预后[13-15]。HOXB3是HOXB 簇基因一员，最新研究发现，HOXB3 作为促癌基因能够促进细胞的增殖、分化及迁移，同时也参与病理生理状态下的血管生成[2-3]。

据相关报道，HOXB3 在结直肠癌中表达上调，与临床分期及不良预后关系密切[4,16]。LncRNA-UCA1 通过miR-28-5p/HOXB3 轴调节结肠癌的进展[17]。HOXB3 缺失与激素受体阴性乳腺癌的发生有关[5]；HOX 转录反义RNA 降解可引起人卵巢癌细胞凋亡和坏死，HOXB3 是高级别浆液性卵巢癌术后复发的生物标志物[6]。MiR-224 通过调控靶基因HOXB3 及调节细胞周期相关蛋白的表达，参与大肠癌细胞的增殖与凋亡[18]。HOXA4/HOXB3基因可作为原发性浆液性卵巢癌术后和一线辅助化疗后复发的生物标志物[19]。揭示了HOXB3 的致癌基因属性，表明其在肿瘤恶变发生中确实发挥着至关重要的作用，促进了肿瘤的发生与发展[4-5]。而本研究前期检索osteosarcoma R2 数据库发现HOXB3在骨肉瘤中呈现高表达预后差特征，检测骨肉瘤临床组织得出同样高表达结果，暗示了HOXB3 在骨肉瘤中的重要作用。通过细胞实验验证发现，敲低HOXB3 表达后细胞增殖、克隆形成、迁移能力明显抑制，细胞凋亡加速，证实其在骨肉瘤发生发展中扮演促癌基因，故进一步研究其发挥作用的潜在机制意义显著。

细胞的快速生长及分化是恶性细胞的共同特征，细胞周期调节蛋白表达异常是促使肿瘤发生的因素之一[20]。CDCA3 是细胞分裂周期相关蛋白，是细胞标识进入有丝分裂的触发因子，可调节细胞周期进程[7]。CDCA3 作为SCF 泛素连接酶（E3）复合物的组成部分，可调控E3 连接酶SCF 介导的激酶抑制和有丝分裂的破坏，降解内源性细胞周期抑制剂进而参与调控细胞周期[21]。近年研究发现，CDCA3 在多种肿瘤中表达上调，通过调控细胞周期参与肿瘤的发生[22-23]。HOXB3/CDCA3 调控电路有助于急性髓系白血病的发生[24]。另于2013年CHEN 等[25]研究表明，HOXB3 通过上调CDCA3促进了前列腺癌细胞进展，发现PC-3 细胞中HOXB3 缺失降低了CDCA3 依赖的增殖能力，同时ChIP 分析发现HOXB3 能够结合CDCA3 启动子区域并激活CDCA3 表达，表明CDCA3 是HOXB3的一个重要靶基因。为进一步明确CDCA3 和HOXB3 在骨肉瘤中的调控作用，研究发现CDCA3在骨肉瘤组织中同样表达上调，同样存在高表达预后差特征，且CDCA3 和HOXB3 两者表达呈显著正相关；同时ChIP 分析和荧光霉素报告基因实验证实，HOXB3 与CDCA3 启动子区域存在结合位点，敲低HOXB3 表达可显著降低CDCA3 表达，推测两者可能通过某种调控关系参与发挥作用。后期细胞实验证实，敲低CDCA3 表达明显抑制了骨肉瘤细胞增殖及克隆形成；细胞回补实验验证发现，回补CDCA3 可使原本敲低HOXB3 受抑制的细胞增殖率、克隆形成率及细胞迁移率逐渐恢复正常，细胞凋亡率明显降低，表明HOXB3 可能通过正向调控CDCA3 表达从而在骨肉瘤中发挥功能。本研究从HOXB3 表达特征、功能验证及下游靶基因功能验证对其促进骨肉瘤发生发展的作用进行了初步研究，然而对HOXB3 与CDCA3 的相互调控作用关系及影响骨肉瘤细胞生物学行为的机制不够深入具体，后期还需进一步探究分析阐明。

综上所述，HOXB3 在骨肉瘤中表达上调，其可能通过与CDCA3 启动子区域结合，正向调控CDCA3 表达促进骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成及迁移，抑制细胞凋亡，进而发挥作用。