2型糖尿病肾病患者外周血micorRNA-155水平与肾小球滤过率的相关性研究

沈伟兴，汤佳瑾，傅 鹏（上海市市东医院.肾内科；.重症医学科，上海 200438）

糖尿病肾病是糖尿病的一种严重并发症，慢性炎症反应在糖尿病及糖尿病肾病的发生发展过程中发挥重要作用，且炎性反应与糖尿病血管病变及其严重程度之间的关系已成为目前研究热点[1]。微小核糖核酸-155（miRNA-155，miR-155）是人体内一种具有炎性功能作用的miRNA，在肿瘤、心脑血管疾病诊断和预后方面已经得到广泛关注；同时可溶性细胞间黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）、细胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）均属于参与机体病理过程的重要炎症因子，但三者在2型糖尿病及糖尿病肾病慢性血管病变中的参与机制及调控作用尚且研究较少[2-3]。糖尿病肾病患者常存在一定程度肾功能损伤，估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)常用于临床评估患者肾脏功能和慢性肾脏疾病分期情况，监测eGFR水平变化对于糖尿病肾病治疗和预后具有重要临床意义[4]。本研究通过以不同eGFR水平糖尿病肾病患者作为研究对象，观察血清miRNA-155，NF-kB 以及sICAM-1水平，考察外周血miRNA-155 与eGFR 之间的相关性，以期为miRNA-155 在糖尿病肾病中的发病机制以及临床治疗方法提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年4月～2019年12月上海市市东医院收治的132 例2型糖尿病肾病患者为研究对象，参考慢性肾脏病流行病学合作研究公式[5-6]：eGFR（ml/min/1.73m2）=186×［血肌酐（μmol/L）×0.0113］-1.154×年龄-0.203×（0.742女性）×（1.233 中国人）计算所有患者的eGFR水平，并根据其eGFR水平分为A 组（eGFR＞90ml/min/1.73m2）56 例，B 组（60ml/min/1.73m2≤eGFR＜90ml/min/1.73m2）48 例，C 组（eGFR＜60ml/min/1.73m2）28 例。另选择同期健康体检者40 例作为对照组。各组患者的性别、舒张压差异无统计学意义（均P＞0.05），年龄、收缩压差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。所有患者均在知情同意书上签字，且本研究得到我院伦理委员会许可。

表1 各组一般临床资料比较[n（%）]

纳入标准：①A，B，C 组患者均确诊为糖尿病肾病，均符合WHO 发布的糖尿病诊断和分型标准[7]：空腹、餐后2h静脉血浆血糖分别≥7.0mmol/L，≥11.1mmol/L；以及糖尿病肾病临床指南[8]：尿清蛋白排泄率（urinary albumin excretion rates，UAER）≥30 mg/24 h；②自愿签署知情同意书并能配合研究者。

排除标准：①并发其他肾脏疾病者；②存在糖尿病急性并发症、感染性疾病、血液及严重免疫系统疾病者；③并发恶性肿瘤、原发性肝脏疾病患者。

1.2 仪器与试剂 离心机（长沙湘仪仪器厂，型号：TG18-WS）；酶标仪（美国Thermo Scientific，型号，Multiskan Sky）；高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，型号：Agilent 1200）；全自动生化分析仪[日立(中国)有限公司，型号：7600-020]；RNA提取试剂盒（默克Sigma-Aldrich）；ELISA 试剂盒（美国Abcam 公司）；miRNA 专用逆转录试剂盒（Takara 公司）。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集：收集所有患者的一般临床资料，主要包括年龄、性别、糖尿病病程、血压（舒张压、收缩压），其中血压为患者就诊后或体检时静息15min 后测量。另外采集清晨空腹血液10ml 于肝素抗凝管中，使用全自动生化分析仪测定各生化参数水平，其中清蛋白(albumin，ALB)采用溴甲酚绿法测定，血尿酸(serum uric acid，SUA)水平采用过氧化物酶法测定，尿素氮(urea nitrogen，BUN)水平采用尿素酶法测定，肌酐(serum creatinine，SCr)水平采用肌氨酸氧化酶法测定，总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平采用终点法测定。高效液相法测定糖化血红蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)水平。

1.3.2 血清sICAM-1，NF-κB 表达水平比较：将采集的血液进行3 000r/min 离心20min（离心半径为10cm），得到分离血清后，采用ELISA 试剂盒检测所有患者血清sICAM-1，NF-κB水平。所有操作均按试剂盒操作说明进行，使用酶标仪进行样品检测，绘制ELISA 标准曲线并根据标准曲线计算患者各血清因子水平。

1.3.3 miRNA-155 表达水平检测：参照总RNA 提取试剂盒说明书提取外周血中总RNA，然后采用miRNA 专用逆转录试剂盒进行 miRNA 逆转录和PCR，其中内参物为U6，PCR 反应条件为95 ℃预变性20 s，95 ℃变性10s，60℃退火 20s，72℃延伸15s，连续40 个循环。然后根据内参采用2-△△Ct分别计算 miRNA-155 相对表达量（RQ）。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用百分比表示，采用χ2检验；多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；采用Pearson 法分析miRNA-155 与eGFR 之间相关性，数据均符合正态分布，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料及实验室检测数据比较 见表1、表2。各组性别、舒张压、TG 比较差异无统计学意义（F/χ2=2.295，0.282，0.220，均P＞0.05），各组年龄、收缩压，HbA1c，TC，HDL-C，LDL-C，ALB，BUN，SCr 以及SUA 差异均有统计学意义（F/χ2=4.578～1 591.01，均P＜0.001）。

表2 .各组一般实验室检测数据比较（±s）

表2 .各组一般实验室检测数据比较（±s）

注：※ 与对照组比较，t=18.807,10.235,8.895,9.745,10.589,12.456,4.235,8.956,10.365,15.326,11.245,13.689,15.261,20.326,21.021,22.326,10.235,13.256,6.547,均P＜0.05；#与A 组比较，t=10.625,6.415,7.246,8.841,9.841,10.476,9.545,16.232,14.326,13.456,4.654,5.698,均P＜0.05；△与B 组比较，t=6.174,5.698,10.265,5.841,12.265,3.569,10.232,均P＜0.05。

项 目对照组（n=40）A 组（n=56）B 组（n=48）C 组（n=28）F/χ2P HbA1c（%）5.32±0.528.84±1.25*8.92±1.35*8.96±1.52*119.211＜0.001 TC（mmol/L）3.85±0.744.25±1.20*4.67±1.31*#5.74±1.48*#△21.614＜0.001 TG（mmol/L）1.48±0.921.52±0.841.58±0.861.62±0.940.2200.882 HDL-C（mmol/L）1.18±0.351.14±0.39*1.20±0.26#1.41±0.42*#△4.5780.004 LDL-C（mmol/L）2.14±0.472.08±0.522.19±0.612.68±0.68*#△10.106＜0.001 ALB（g/L）42.32±3.6541.43±3.6840.12±3.35*36.16±3.12*#△26.643＜0.001 BUN（mmol/L）5.21±1.235.26±1.416.54±1.85*#8.78±2.15*#△45.605＜0.001 SCr（μmol/L）48.52±5.4856.25±6.89*85.74±7.41*#156.56±12.20*#△1 591.01＜0.001 SUA（μmol/L）260.45±23.32278.52±25.25*315.40±30.25*#359.42±35.66*#△107.052＜0.001

2.2 各组miRNA-155，NF-κB 以及sICAM-1水平比较 见表3。糖尿病肾病B、C 组miRNA-155，NF-κB 以及sICAM-1水平均高于对照组和A 组，eGFR 低于对照组（F=9.56～628.83,P＜0.001）；与B 组比较，C 组miRNA-155，NF-κB 以及sICAM-1升高，eGFR 下降，差异均有统计学意义（P＜0.001）。

表3 各组miRNA-155，NF-κB 以及sICAM-1水平比较（±s）

表3 各组miRNA-155，NF-κB 以及sICAM-1水平比较（±s）

注：※与对照组比较，t=6.254,4.235,6.295,3.515,10.235,8.654,7.565,6.254,均P＜0.05；#与A 组比较，t=4.265,5.262,3.245,2.369,6.215,5.481,3.478,3.214,均P＜0.05；△与B 组比较，t=5.202,2.321,5.698,4.784,均P＜0.05。

项目对照组（n=40）A 组（n=56）B 组（n=48）C 组（n=28）FP miRNA-155 相对表达量1.25±0.211.26±0.241.45±0.28*#1.98±0.32*#△68.12＜0.001 NF-kB（ng/ml）1.64±0.351.68±0.381.86±0.41*#2.07±0.45*#△9.56＜0.001 sICAM-1（μg/ml）1.02±0.261.04±0.311.49±0.45*#2.15±0.52*#△75.24＜0.001 eGFR[ml/（min·1.73m2）]115.65±10.47113.98±10.2275.68±8.48*#41.67±6.52*#△628.83＜0.001

2.3 Pearson 相关性分析 miRNA-155，NF-κB，sICAM-1 均与eGFR 呈负相关(r=-0.498,-0.514,-0.398,均P＜0.05)；ALB 与eGFR 呈正相关(r=0.232，P＜0.05)；miRNA-155 与NF-κB，sICAM-1，HbA1c 均呈正相关（r=0.489,0.423,0.212,均P＜0.05）。

2.4 多元线性回归分析 见表4。以eGFR 作为因变量，以miRNA-155，NF-κB，sICAM-1作为自变量，采用逐步回归法进行多元线性回归分析，所有自变量均取实际值进行分析，结果表明：miRNA-155,NF-κB,sICAM-1 均是影响eGFR 的独立影响因素（t=2.626,2.120,1.569，均P＜0.001）。

表4 多元线性回归分析

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病的严重微血管病变并发症，是导致糖尿病患者终末期肾脏衰竭和预后不良的主要病因，糖尿病肾病的主要症状包括肾小球滤过率下降、血压升高甚至出现蛋白尿等[9]。随着大量研究证实炎症反应在糖尿病血管病变和糖尿病肾病发生发展过程中发挥重要促进作用，炎症反应与疾病进展之间的相关性已经成为目前研究重点。NF-κB，sICAM-1 作为众所周知的炎症因子，参与了糖尿病炎症反应过程[2-3]。微小 RNA(miRNAs)作为一类具有调控促炎和抑炎因子表达水平的关键因子，其在免疫和炎症反应过程中发挥重要调控作用，可能也参与了糖尿病肾病的炎症反应过程[10-11]。eGFR 是评估慢性肾脏疾病分期的关键参数，eGFR水平与糖尿病肾病等肾脏疾病的肾功能存在密切联系，因此深入分析炎症因子及miR-155 等miRNA水平与eGFR 之间的关系，对于探讨糖尿病肾病发病机制以及开发有效的糖尿病肾病治疗方案并改善患者预后具有重要临床价值。

miR-155 作为目前发现的靶基因最多的具有炎性功能miRNAs 之一，与机体炎症和免疫等生理病理过程关系密切。李露露等[10]研究证实发生血管病变的2型糖尿病患者的血清miR-155 表达水平显著高于单纯2型糖尿病患者（P＜0.05），提示miR-155 在糖尿病慢性血管病变的发生和发展过程中具有关键作用。本文研究结果显示糖尿病肾病B，C 组miRNA-155水平均高于对照组和A 组，C 组miRNA-155 高于B 组，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。陈明等[12]最新研究报道，miR-155 参与炎症反应的机制可能是因为miR-155 可以靶向抑制细胞因子信号转导抑制分子（SOCS1）使其表达水平下调，通过调节下游酪氨酸激酶（JAK）/转录激活因子（STAT）信号通路，从而诱导白介素-12（IL-12）等炎症标志物的表达，介导T淋巴细胞免疫。

NF-κB，sICAM-1 作为机体重要炎症因子，也在糖尿病炎症反应过程中发挥重要作用。在炎症因子或趋化因子等刺激作用下，导致抑制性κB(Inhibitor Kappa B,IκB)降解，促进NF-κB 依赖基因转录和表达量增加。sICAM-1 作为ICAM-1 可溶形式，在炎症因子刺激下ICAM-1 可在血管内皮细胞大量表达，增加白细胞和血管内皮细胞之间的黏附，对动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）等血管病变过程产生促进作用[13-14]。XU 等[15]研究表明T2DM 患者外周血单核细胞NF-κB 活性明显高于对照组，且NF-κB 活性及表达水平与蛋白尿严重程度呈正相关，提示NF-κB 活性与糖尿病肾病严重程度存在密切相关性。另有崔俊芳[16]通过研究表明，糖尿病患者出现视网膜微血管病变前期，NF-κB 表达水平会出现异常改变，且NF-κB水平随着病程延长和血管病变程度增加而增加，证实NF-κB 在糖尿病血管病变并发症发生发展过程中发挥重要作用。

本文相关性研究结果表明miRNA-155，NF-κB，sICAM-1 均与eGFR 呈负相关，miRNA-155 分别与NF-κB，sICAM-1，HbA1c 呈正相关，且miRNA-155，NF-κB，sICAM-1，病程、收缩压是影响eGFR的独立影响因素。结果提示miRNA-155，NF-kB，sICAM-1 表达水平越高，机体炎性反应程度越高，糖尿病肾病严重程度加重，肾功能下降程度越大，与前人研究结论一致。结合文献[16-18]报道推测三者相互作用参与炎性反应的机制：NF-κB 可以通过与miR-155 上游-178 位点发生特异性结合，激活后的NF-κB 通路以及NF-κB，sICAM-1 的高表达可以诱导miR155 HGmRNA 以及成熟miR-155 的大量表达，而miR-155 又可以通过负反馈方式对细胞因子发挥抑制作用，产生促炎效应，从而促进并加重糖尿病肾病并发症的发生和发展[19-20]。

综上所述，miR-155，NF-κB，sICAM-1 三者关系紧密，可引发炎症反应并共同参与糖尿病肾病发生过程，糖尿病肾病患者外周血miR-155 异常高表达且与疾病严重程度和eGFR水平存在显著相关性，有望成为糖尿病肾病早期诊断和治疗的有效生物标志物之一。