马钱子总碱脂质液晶纳米粒镇痛凝胶的研制

王晓慧，孙双姣，张运良，李明娟，李成舰

(1.邵阳学院 药学院，湖南 邵阳，422000；2.湘西南中药开发利用湖南省工程研究中心，湖南 邵阳，422000)

马钱子为马钱科植物马钱子的干燥成熟种子，有毒，具有通络散结、消肿止痛之效[1]。而其镇痛的活性成分为马钱子碱(本研究以马钱子碱为考察指标)，主要用于风湿痹症、骨关节炎的治疗[1-4]。其优点是镇痛作用大、无依赖性[3]，但因其安全范围窄，供临床使用的制剂甚少。

以脂质体为载体的药物易在角质层内形成药物储库，可持续地对病变细胞起到治疗作用，提高治疗指数，减少全身毒副作用[4]，同时，因其与皮肤角质层的脂质有高度的生物相容性，从而增加了药物在皮肤局部的积累，起到持续地释放药物的作用[5]。

硫酸铵梯度主动载药技术利用药物对硫酸铵电离形式的依赖性，以电中性形式而非电离形式跨越脂质双层，通过形成脂质体膜内、外水相pH 值差异，促使外水相药物自发向脂质体内部聚集，从而获得较高的药物包封率[6-7]。

本研究尝试用硫酸铵主动载药技术制备马钱子脂质液晶纳米粒(TAB-LLCN)，并制成马钱子总碱脂质液晶纳米粒镇痛凝胶(TAB-LLCN-Gel)，强化促渗剂效能、提高载药量，通过马钱子碱的缓慢和持续释放，起到“减毒增效”的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1220Serie高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，78HW～1恒温磁力加热搅拌器(常州荣华仪器制造有限公司)，RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KQ-500B-超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，H1850高速离心机(湖南湘仪动力测试仪器有限公司)，Zetasizer Nano ZSP纳米粒度电位仪(富瑞博国际有限公司)；FEI透射电子显微镜(美国赛默飞世尔科技)；ZTY智能透皮吸收实验仪-TP2A(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 药物

马钱子粉(云南产，原药购于邵东市廉桥镇，砂烫法炮制后去壳，粉末研磨过50目筛，备用)；马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110705—202006)；庚烷磺酸钠(北京奥秘佳得医药科技有限公司，批号20200928)，大豆卵磷脂[艾伟拓(上海)医药科技有限公司，批号20200427]；胆固醇[艾伟拓(上海)医药科技有限公司，批号20191015]；其他试剂均为分析纯或色谱纯；水为超纯水。

1.3 动物

SPF级KM小鼠，雄性，体重为18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(湘)2019-0004。

1.4 方法

1.4.1 马钱子总碱脂质液晶纳米粒的凝胶制备

自备含马钱子碱(20.06±0.03) mg/mL的溶液。

马钱子总碱脂质液晶纳米粒(TAB-LLCN)制备流程，见图1。工艺参数脂-药比为10∶1、磷脂-胆固醇比为6∶1、硫酸铵溶液的浓度为0.2 mg/mL，乙醇的体积为12 mL/100 g。

图1 马钱子总碱脂质液晶纳米粒制备流程图Fig.1 Flow chart of preparation of Brucine total alkali nanoliposomes

取TAB-LLCN(1 mg/mL)10 mL，加适量促渗剂，4 mL BBS溶液(pH 6.00～6.80)，将三乙醇胺的pH值调为6.00～6.80，加0.01 mol/mL盐酸甲醇溶液至50 g后与预先配制好的卡波姆940(20 mg/mL)等量混合均匀，即得到100 g TAB-LLCN-Gel(含马钱子碱约100 μg/g)。

将上述TAB-LLCN换成TAB(1 mg/mL)10 mL，其余步骤相同，即得到100 g TAB-Gel(含马钱子碱约100 μg/g)。

1.4.2 TAB-LLCN的表征

采用Zeta 电位粒度测定仪，超纯水为分散介质，测得TAB-LLCN的Zeta电位为-36 mV、平均粒径为(172±6.19) nm，见图2。用透射电子显微镜观察并拍摄照片，见图3。发现TAB-LLCN成球形，形态完整，分界明显。

图2 脂质体制备流程图Fig.2 Size distribution of liposomes

图3 脂质体扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy of liposomes

1.4.3 含量测定方法的建立

1.4.3.1 色谱条件

HypersilC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：流动相A(79%)为缓冲盐(0.01 mol/mL的庚烷磺酸钠和0.02 mol/mL磷酸二氢钠等量混合，缓冲盐用100 mg/mL的磷酸盐调至pH 2.8)，流动相B(21%)为乙腈； 流速为1 mL/min-1，检测波长为262 nm，进样量为20 μL，柱温为30 ℃。

1.4.3.2 线性关系的确定

分别精密移取对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL定容于10 mL的容量瓶中，以甲醇溶液为空白，于262 nm处，进样20 μL，以峰面积S为纵坐标，质量浓度C(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，拟合后分别得到马钱子碱的回归方程为S=20.649C-3.51，R2=0.999 4(n=6)，线性范围为2～12 mg/mL。

1.4.3.3 精密度实验

分别取对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL，记录马钱子碱的峰面积S，结果测得马钱子碱峰面积RSD为0.69%～1.31%(n=6)。

1.4.3.4 加样回收率实验

在3个浓度均为8.12 μg/mL的供试液中分别加入4，8和12 μg/mL的标准溶液，摇匀后分别进样20 μL，记录峰面积S，每个样品重复测定3次，得到马钱子碱的平均回收率(n=3)为100.26 %，100.52%，100.29%，平均RSD(n=3)为0.51%，0.43%，0.39%。

1.4.3.5 凝胶的含量测定

取凝胶0.5 g，加甲醇 10 mL，超声搅拌3～5 min，高速(7 200 r/min )离心 30 min，转移至 25 mL 容量瓶中定容。取上清液，无水硫酸钠脱水后用0.45 μm 微孔滤膜滤过。精密吸取滤液1 mL，用0.01 mg/mL 甲醇溶液稀释至标准溶液浓度范围内，于262 nm处进样20 μL，记录峰面积S，计算含量C。

1.4.4 体外透皮吸收实验

采用改良的Franze扩散池[8-9]，容积为6.3 mL，有效吸收面积为1 cm2。加入6 mL混合磷酸盐缓冲液(pH 6.00～6.80)作为接收液，将处理好的离体小鼠腹皮(5 mg/mL的硫化钠脱毛)于扩散池固定好，取1 g凝胶均匀涂抹于离体小鼠腹皮上。然后，将扩散池置于(37±0.5) ℃的恒温水浴槽中， 在磁力搅拌器持续搅拌下，分别于0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0和24.0 h 取出5.0 mL接收液， 同时，补以同体积的空白接收液。将5.0 mL接收液稀释至标准溶液浓度范围内，以混合磷酸盐缓冲液(pH 6.00～6.80)为空白对照，于262 nm处进样20 μL，记录峰面积，计算相应的药物浓度Cn，按公式(1)计算单位面积累积释药量Q

(1)

其中，Cn为第n个取样点测得的药物浓度；V为接收池的总体；S为有效扩散面积。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 TAB-LLCN-Gel的制剂处方的优化

2.1.1 单因素分析实验

选定载药量(a)、促渗剂的品种(b)、促渗剂的用量(c)、氮酮∶丙二醇∶桉叶油的比例(d)4个影响因素进行单因素分析。在其他因素不变的情况下，改变任一因素，通过5个水平的变化，考察各因素对马钱子碱Q24的影响，以确定各因素的响应点。因素水平表见表1，各因素对马钱子碱Q24的影响结果见图4。结果显示，载药量为100 μg/g、氮酮浓度为3%、氮酮∶丙二醇∶桉叶油的比例为2∶2∶1时为最佳处方方案。载药量超过100 μg/g (临床使用最低起效量)后，增大载药量，并不增加Q，提示凝胶载药具有一定的饱和性，释药量具有剂量依赖性。

表1 因素水平表(单因素分析)

图4 各因素对Q24的影响结果(单因素)Fig.4 Effects of various factors on Q24 (single factor)

2.1.2 正交设计实验

结合单因素分析确定氮酮的浓度%(A)、(氮酮∶丙二醇∶桉叶油的比例(B)、载药量(C)、方差(D)为考察因素，以马钱子碱Q24为考察指标，采用L9(34)正交设计实验，因素水平表见表2，正交实验结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平表(正交设计)

表3 正交设计实验结果

表4 正交实验主体间效应检验结果(方差分析)

直观分析最优处方方案为A3C1B2， 主次影响因素的顺序为：A>C>B。方差分析结果与直观分析相符，主体间效应检验差异有统计学意义(P<0.05)。在载药量为100 μg/g、氮酮浓度为30 mg/mL、氮酮∶丙二醇∶桉叶油的比例为2∶2∶1时为最佳处方方案，与实验结果相符。

2.1.3 优化处方验证性实验

按照最优处方方案平行制备3份，马钱子碱Q24为(85.16±0.19) μg/cm2，RSD为0.19%。最优处方方案稳定可靠，质量可控。

2.2 TAB-LLCN-Gel体外渗透动力学考察

2.2.1 24 h单位面积累积渗透量Q24实验

选用最优处方方案分别制备TAB-LLCN-Gel和TAB-Gel。用1.4的方法，结果见表5。结果显示，TAB-LLCN-Gel中马钱子碱Q24均大于TAB-Gel(P<0.05)。

表5 TAB-LLCN-Gel和TAB-Gel Q24(n=6)

2.2.2 皮肤滞留量(Qs)实验

体外透皮吸收实验结束后，用生理盐水洗净，取下有效皮肤表面的药物并尽量剪碎，加1 mL甲醇，涡旋5 min，超声30 min，5 000 r/min 离心10 min，取上清液用0.45 μm 微孔滤膜滤过，滤液按照含量测定的方法测定，记录峰面积S，按照公式(2)计算皮肤滞留量Qs。

Qs=VC/A

(2)

其中，A为有效扩散面积，cm2；V为溶解样品的体积，mL；C为测得的马钱子碱浓度，μg/mL。

结果Qs(TAB-LLCN-Gel)(12.50±0.37) μg/cm2>Qs(TAB-Gel)(8.04±0.29) μg/cm2，P=0.003 3。经t检验，P<0.05。

2.2.3 渗透动力学参数和方程拟合

将最优方案制得的TAB-LLCN-Gel的Q24与时间(t)的零级、Higuchi(渗透)方程，用OriginPro 9.0软件模拟拟合(渗透动力学方程的斜率即为稳态渗透速率Js)。方程拟合结果见表6，渗透动力学参数见表7。

表6 渗透动力学方程拟合结果

表7 药动学参数(n=6)

结果显示，TAB-LLCN-Gel中马钱子碱的Js24均大于TAB-Gel(P<0.05)。

3 讨论

本实验采用硫酸铵主动载药技术制备TAB - LLCN，并尝试制成TAB- LLCN-Gel，从实验结果来看，TAB-LLCN表征相对稳定。制备的TAB-LLCN-Gel的皮肤贮库明显有利于药物持续缓慢地释放，从而对药物起到减毒增效的作用。

本研究制备的TAB-LLCN-Gel中马钱子碱Q24和Qs24的增大可能会导致体内吸收增加，应密切关注血药浓度是否在治疗窗内，同时需要对TAB-LLCN-Gel的剂量进行规范、准确地分割，以免产生中毒反应。皮肤贮库效应和促渗效应对TAB-LLCN-Gel在体内经皮吸收后的变化的影响还不清楚，未来还需进一步深入研究体内经皮吸收行为，探索其体内准确释放的规律。