基于网络药理学探讨金匮肾气丸治疗良性前列腺增生症的潜在作用机制

2022-03-05邵波，田申，万水*

现代中药研究与实践 2022年6期

邵波，田申，万水*

（1.安徽中医药大学附属芜湖市中医医院专业学位硕士研究生培养基地，安徽芜湖 241002；2.安徽中医药高等专科学校附属医院/芜湖市中医医院泌尿外科，安徽芜湖 241002）

良性前列腺增生（BPH）相当于中医“精癃”的范畴，又称癃闭，以小便排出困难为主症，小便滴沥量少而能出者称之为“癃”，小便完全闭塞、少许亦不能出者称之为“闭”。目前西医治疗BPH 包括随访观察、口服药物缓解和手术治疗等方式，而大多数轻症患者都会逐渐发展至必须手术治疗[1]，且术后复发率高，患者经济负担大，严重影响患者生活质量。中医认为其病机以“湿热蕴结下焦，肾与膀胱气化不利”为主，病理因素本在肾虚、标在湿热。金匮肾气丸出自汉代医家张仲景之手，见于《金匮要略》，由熟地黄、淮山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻、附子、桂枝8 味中药组成，被誉为“补肾诸方之祖”[2]，具有温补肾阳肾气、行气利水的功效，与BPH 肾气亏虚为本的病机相适应。目前，临床运用此方治疗BPH 较为普遍，取得了较好的临床效果，随访观察复发率亦低，但具体作用机制认识尚浅。本研究将通过网络药理学和分子对接技术，阐明其药物作用的潜在机制，以期为金匮肾气丸治疗BPH 的进一步研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 药物相关成分和靶点筛选

通过TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）搜集金匮肾气丸药之“熟地黄、淮山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻、附子、桂枝”8 味中药的有效化学成分，按照口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 进行筛选。利用筛选出的化学成分确定相对应的中药靶点基因。

1.2 BPH 相关靶点基因筛选

以“Benign prostatic hyperplasia”作为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）5 个数据库中搜索疾病相关基因，将所得基因合并，删除重复值后得到交集基因，通过ClusterProfile R package 绘制Venn 图。

1.3 中药成分靶基因与BPH 相关基因合并

将“1.1”“1.2”步骤中所得的中药靶基因和疾病相关基因导入ClusterProfile R package 之中，得到交集基因，并绘制Venn 图。

1.4 中药复方调控网络、蛋白互作网络（PPI）构建

将“1.3”中所得交集基因整理，导入Cytoscape 3.8.0 软件，绘制中药复方调控网络，即“成分-靶点-通路”网络图。将交集基因导入在线网络平台STRING11，分析药物靶点和基因之间是否存在相互作用的关系，构建蛋白互作网络（PPI），将所得蛋白互作关系导入Cytoscape 3.8.0 软件之中，由ClusterProfile R package 进行两次筛选，得到PPI 网络核心基因。

1.5 GO 功能注释和KEGG 通路富集分析

将“1.3”中得到的中药成分和疾病的交集基因，导入ClusterProfile R package进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，绘制相应的柱状图和气泡图。

1.6 蛋白与分子对接

选取PPI 网络中Degree 值排名前三的基因及其所对应的有效成分进行分子对接，具体步骤如下：①构建小分子配体：在PubChem 数据库中下载小分子配体2D 结构，导入ChemBio3D 软件中转化为3D 结构，设置最小自由能优化。②蛋白受体准备：将核心基因在uniprot 数据库对应的ID 输入PDB 数据库中，得到蛋白受体的3D 结构。③PTBQT 文件准备及确定活性口袋：将蛋白受体和小分子配体的3D 结构导入AutoDockTool 软件中，蛋白分子去除水分子并加氢，3D 结构转化为2D 结构并去线条，调整参数利用活性口袋将受体分子实行全覆盖后导出。④分子对接：配体、受体及其活性口袋的相关参数导入Vina软件中，分子对接后导出，利用PyMOL 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 金匮肾气丸有效成分和靶点基因筛选

TCMSP 数据库检索筛选后得到金匮肾气丸有效化学成分共102 种，包含熟地黄2 种、山药16 种、山茱萸20 种、牡丹皮11 种、茯苓15 种、泽泻10 种、附子21 种、桂枝7 种。有效化学成分对应基因靶点688 个。

2.2 BPH 的基因靶点筛选

通过5 个数据库检索、合并删除重复值，得到疾病相关基因3 404 个，其中交集基因135 个，见图1。

图1 疾病相关基因Venn 图Fig. 1 Venn diagram of disease-related genes

2.3 中药靶基因与BPH 疾病基因合并

将中药成分靶基因与疾病相关基因合并，得到交集基因共155 个，见图2。

图2 药物成分靶点与疾病相关基因靶点交集Venn 图Fig. 2 Venn diagram of genes of intersections of target genes of active components of Jinkui Shenqi pills and BPH-related genes

2.4 中药复方调控网络及蛋白互作网络（PPI）构建

中药复方调控网络显示，有效核心成分共48 种，β-谷甾醇、槲皮素、水黄皮素、山柰酚、常春藤对应靶点基因共155 种，有效成分中评分较高的是苷、豆固烯醇等，分值较高靶点有PTGS1、PTGS2、NCOA2、ESR1、ADRA1B、HSP90AB1、PGR等，见图3。PPI 网络图中含有11 个节点和90 条互作边，见图4。11 个核心基因按照Degree 值从高到低排列依次为：JUN、ESR1、MYC、RELA、HIF1A、TP53、MAPK1、FOS、CCND1、NR3C1、AKT1，见图5。

图3 中药复方调控网络图Fig. 3 Regulatory network of Jinkui Shenqi Pills

图4 蛋白互作网络图Fig. 4 Protein-protein interaction（PPI）network

图5 PPI 最终网络核心图Fig. 5 Final core of PPI network

2.5 GO 功能注释和KEGG 通路富集分析

GO 功能注释显示，靶点基因参与了组织氧化应激反应、DNA 结合转录因子结合、脂筏、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、细胞对化学应激的反应等过程，见图6。KEGG 富集分析显示这些反应过程可通过PI3K-Akt 通路、化学致癌通路、血脂与动脉粥样硬化通路等通路发生，见图7。

图6 GO 功能注释气泡图Fig. 6 Bubble chart of GO functional annotation analysis

图7 KEGG 富集通路柱状图Fig. 7 Bar chart of KEGG signaling pathway enrichment analysis

2.6 分子对接结果

按照Degree 值排名前三的核心基因及所对应的有效成分完成分子对接，核心基因是JUN、ESR1、MYC，对应的有效成分是β-谷甾醇、水黄皮素、槲皮素。结果显示，核心基因与有效成分均能自由有效结合，JUN与β-谷甾醇、ESR1与水黄皮素、MYC与槲皮素结合的最小自由能分别为-13.7 kcal/mol、-8.2 kcal/mol、-5.7 kcal/mol，最佳对接结果见图8。

图8 JUN 与β-谷甾醇(A)、ESR1 与水黄皮素(B)、MYC 与槲皮素(C)分子对接结果Fig. 8 Molecular Docking Results of JUN with β-sitosterol ( A ), ESR1 with xanthatin ( B ), MYC with quercetin ( C )

3 讨论

现代研究表明，金匮肾气丸具有抗肿瘤、强免疫、促凋亡作用[3-4]。本研究通过PPI 网络进行核心基因筛选，得到金匮肾气丸治疗BPH 的核心靶点，靶点基因参与细胞凋亡、免疫调节、抗炎等作用机制过程。JUN是位于1 号染色体的遗传基因，由C-JUN蛋白、JUNB和JUND 等亚基因组成的基因大家族[5]，与FOS 原癌基因产物组成激活蛋白-1（AP-1）对人体细胞正常的增殖调控、分化调节及细胞凋亡起着十分重要的作用[6]。ESR1即雌激素受体α（ESRα）,具有多态性特征，最常见的多态性存在于Xbal 和PvuⅡ两个位点，该位点可促使中老年男性前列腺组织增生，有癌变风险[7]。MYC是染色体8q24 上的调控基因，属于原癌基因，MYC基因参与细胞增长分化、代谢凋亡等多个生理病理过程[8]，研究得出，肿瘤细胞MYC的表达水平较正常组织明显升高，MYC编码的蛋白质借助与DNA 结合，允许通过RNA 聚合酶Ⅱ转录成rRNA、C-MYC mRNA 和蛋白的生物量增多，从而使凋亡和新生平衡失调，导致BPH 发生[9]。

通过GO 功能注释结果显示，金匮肾气丸参与调控的分子功能主要富集在细胞化学应激反应、氧化应激反应、DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、脂筏反应等过程之中。KEGG 通路富集分析结果显示，金匮肾气丸主要对血脂与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt 通路、人巨细胞病毒感染通路、化学物致癌作用通路等起调控作用。研究发现，血脂偏高、血压偏高等因素可直接引起血管内皮的损伤，从而加速、促进动脉粥样硬化发生与进展[10]，动脉硬化致使骨盆区域血流减少，前列腺组织缺血缺氧，诱导HIF-1α 等分子表达，刺激前列腺间质细胞和组织生长，导致前列腺增生。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是自噬类信号通路的重要途径，大量研究结果显示，该信号通路被激活时，处于通路上游的PI3K 会首先进行磷酸化反应，磷脂酰肌醇磷酸化为磷脂酰肌醇三磷酸后，结合3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 去磷酸化下游的AKT,进一步磷酸化启动mTOR，mTOR 可通过抑制磷酸化Unc-51 自噬激活激酶1（ULK1）的功能,抑制ULK1 对自噬过程的启动，从而限制了细胞凋亡，引起组织的增生[11]。当人体遭受HCMV 感染侵袭时，抑制因子占优势地位，人体自然杀伤细胞对机体衰老细胞的杀伤效应减弱,产生免疫逃逸、凋亡减少、促进细胞衰老等结果[12]。由以上通路可以推测，金匮肾气丸可能是通过多条信号通路来调节细胞凋亡、增强免疫效应、抑制动脉硬化、减少组织缺血等机制来治疗BPH。

由分子对接结果可知，金匮肾气丸核心成分β-谷甾醇、水黄皮素、槲皮素等与靶点基因JUN、ESR1、MYC最小自由能均小于0，具有较强的结合能力，其中以JUN与β-谷甾醇的结合能力最强。β-谷甾醇属于植物甾醇家族中的一员，具有调控分裂增殖、细胞生长周期、细胞凋亡、抗炎等作用[13]，通过研究富含β-谷甾醇的锯棕榈油（VISPO）对BPH 实验鼠前列腺体积的影响中，发现β-谷甾醇可显著降低前列腺的体积和质量，更有实验数据表明，其通过影响异常增殖细胞的生存周期，氧化应激激活细胞线粒体凋亡，抑制组织增生[14]。水黄皮素产生细胞周期阻滞效应诱导细胞凋亡，减少前列腺体积。槲皮素可降低抗凋亡蛋白Bcl-2 合成、增加促凋亡蛋白BAX 表达，抑制细胞增殖并促进凋亡。山柰酚作用于ESR1、SRC等靶点，调控内分泌抵抗通路，促进前列腺增殖细胞凋亡。常春藤苷可抑制前列腺组织细胞的增殖，促进细胞凋亡发生，发生机制与调控PI3K/Akt 通路有关[15]。豆固烯醇主要作用于TP53、HSP90AA1等靶点，可上调促凋亡p53 表达、下调抗凋亡BCL-2 表达，影响细胞酶结合、蛋白质二聚活性等生物进程，调节机体凋亡及新生平衡。