炮制程度对黄芩炭中黄酮类成分转化及转移率的影响规律研究

孙 静，朱 博，李 宇，杨 丽，陈建波*，董 玲*

（1. 北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2. 北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488）

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellariae baicalensisGeorgi 的干燥根，味苦，性寒，目前临床使用较多的有生黄芩、酒黄芩和黄芩炭[1]。其中黄芩炭炮制历史悠久，在临床中被广泛应用于治疗血热出血、炎性疾病等[2]，其质量控制也越来越受到人们的重视。

黄芩炭收载于多部地方性炮制规范，在炮制终点的判断上以外观描述为主[3-6]，同时在黄芩炭的质量研究中多集中于炒制前后的饮片中黄酮类成分的含量变化[7-10]，但具体的炮制终点仍有待于进一步探索。通过现有资料发现黄芩炭浸膏成分的研究少有报道，而中药汤剂是中医治病中最常用的剂型，其质量会直接影响药效。同时考虑到黄芩炭中黄酮类成分自身的结构特点使其水溶性较差，其在黄芩炭浸膏中的含量变化规律不完全等同于饮片。可见明确黄芩炭饮片及浸膏中有效成分的转化及转移规律对于黄芩炭的质量控制与终点判断是非常必要的。

因此，本研究拟通过改变炒制温度和时间来制备不同炮制程度的黄芩炭饮片，寻找饮片与浸膏中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的转化规律及变化模式，探索四种成分从饮片到浸膏的转移率大小，同时采用PCA 分析对其炮制程度综合评价以更加全面地解读其炮制过程，为建立能够反应临床药效的黄芩炭炮制终点的判断标准奠定基础。

⑧试压合格的管道应及时进行阀门井室安装及沟槽回填，管沟分层填土并用蛙式打夯机夯实。因管线经过地段多为山区，且管道布置曲线较多，为便于以后维修查找，管沟回填后及时埋设水道标。水道标为钢筋混凝土制，沿管线间距100m埋设在管道正上方，并在管道转弯、与道路交叉处设置。水道标埋入地下0.7 m，地面以上0.5m，水道标周围填土应分层回填密实。

1 材料

1.1 仪器

MS-5 型炒货机（常州迈斯机械有限公司）；HW.SY21-KP6 型智能恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪，SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A 型自动进样器（日本岛津公司）；BSA224S 型电子分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；KH7200DB 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BJ-800A 型多功能粉碎机（上海拜杰实业有限公司）；六号药典筛。

1.2 试药

黄芩苷（质量分数：98%，批号：N15GB167969）、汉黄芩苷（质量分数：98%，批号：P09J8F28374）、汉黄芩素（质量分数：98%，批号：M02GB140399）、黄芩素（质量分数：98%，批号：C06M11Y112461）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱级，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；分析纯磷酸（批号：20170225，北京化工厂）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

词汇是文本中最小的语义单位，文化负载词（culture-loaded words)能最直接的反映民族的特有文化。所谓“文化负载词”或“文化承载词”就是“标志某种文化中特有事物的词、词组和习语，反映了特定民族在漫长的历史进程中逐渐积累的、有别于其他民族的、独特的活动方式”（廖七一，2002）。在总体结构上，岭南文化可分为自然物质文化、社会生活文化和精神心理文化三个组成部分。（仲伟合、左岩，2015）包含饮食，服装、交通等大量的物质文化负载词，如：云吞、叉烧、粿汁、卤鸭、点心、大排档等。传统节日、春运、花市、族谱等社会文化负载词。如碉楼、秦琴、粤剧等精神文化层面的负载词。

1.3 饮片

黄芩片（批号：20210401），购于安徽九合堂国药有限公司。经北京中医药大学中药学院王晶娟教授鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根的炮制品。

2 方法与结果

2.1 黄芩炭饮片及浸膏的制备

2.2.4 方法学考察 （1） 线性关系考察 取“2.2.3”项下混合对照品溶液分别按一定的倍数稀释为一系列不同质量浓度的混合对照品溶液，采用0.22 μm微孔滤膜滤过后进样测定，每次10.0 μL，检测完毕后记录各个待测物质的色谱峰面积。以进样质量浓度为横坐标（X，μg/mL），峰面积为纵坐标（Y），绘制各个成分的标准曲线，结果表明，4 个待测成分在一定浓度范围内峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，见表1。

图1 不同炮制程度黄芩炭样品Fig. 1 Scutellariae Radix Charcoalin different processing levels

浸膏的制备：取上述19 批样品各50 g，加9 倍量水浸泡30 min，煮沸后计时30 min，过滤，滤渣再加入7 倍量水进行二次煎煮，煮沸后计时20 min，过滤，合并二次滤液，减压浓缩至生药浓度1 g/mL，冻干即得。同时称量质量计算出膏率，用以研究其转移率大小及变化。

2.2 黄酮类成分含量测定

2.2.1 色 谱 条 件 Gemini C18色 谱 柱（ 4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长：280 nm；流速：1 mL/min；进样量：10μL；柱温：30 ℃。以0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱：0 ～ 25 min，47%B；26 ～ 35 min，47%→60%B；36 ～ 45 min，60%→70%B；45 ～ 60 min，47%B。

归属感是指对人群的喜爱依恋等心理感受，如对住宅的位置、标识物等以及由此而产生的 自豪感和其他特有的感情。任何个人都离不开一定的团体或组织，人们 常常由于相同职业归属于一个单位，由于共同的居住地属于某个地区，从“血缘 ”的家庭关系中扩展到“业缘 ”和“地缘 ”关系，这种“地缘 ”关系由此产生“远亲不如近邻 ”、“落叶归根”等 乡土观念.所以，人们偏爱具有亲切感 、归属感而不感到陌生的生活空间。面对社会、工作、生活中的种种压力，当回到家时从空间之中所得到温暖，压力的释放以及轻松，有着“家”的感觉。当室内的空间会带给人一种舒适感，轻松感，释放精神压力时，便会有归属感。

由图4 各成分载荷图可知，黄芩素与汉黄芩素相聚集，表明其系数显著正相关，再次证明了不同炮制程度的黄芩炭样品中苷元类成分呈现相似的变化模式；黄芩苷与汉黄芩苷相聚集，表明其系数显著正相关，验证其糖苷类成分呈现相似变化模式。

2.2.3 供试品溶液的制备 取“2.1”项下原饮片、黄芩炭饮片的粉末，以及原饮片浸膏冻干粉、黄芩炭浸膏冻干粉0.30 g，精密称定，加70%乙醇40 mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液置100 mL 容量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置2 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

饮片的制备：取同一批黄芩饮片18 份，每份300 g，置于炒货机中，于150、180、210 °C 分别炒制10、20、30、40、50、60 min，另取300 g 黄芩饮片作为原饮片进行对比测定。以上实验均在同一环境下当天制备，以避免外界因素的影响。最终得到共18 批黄芩炭及1 批黄芩饮片，见图1，其中取一部分进行打粉，过六号药典筛，用以检测含量。

表1 19 批样品中4 种成分的线性考察结果Tab. 1 Linear test results of 4 components in 19 batches of samples

进一步将黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量检测结果导入SIMCA 14.1 软件进行分析。主成分分析结果显示主成分1（PC1）与主成分2（PC2）累积方差贡献率为98.7%，表明PC1 和PC2 可以解释说明98.7%的原始信息。19 批黄芩炭质量具有明显差异，可大致分为A、B、C 类，结合外观及化学含量可以认为分别对应“炮制不及”“炮制适中”“炭化过度”，见图3。

（3） 稳定性试验 取同一供试品溶液［180℃（30 min）的黄芩炭饮片］，分别于制备后0、2、4、6、12、24 h 内进样测定，记录各待测物质的色谱峰面积，计算RSD。结果显示，4 个待测物质在24 h 内色谱峰面积的RSD 分别是0.73%、0.12%、0.23%、1.50%，均小于2.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

（4）重复性试验 取同一批次［180℃（30 min）］黄芩炭饮片粉末0.30 g，共6 份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。结果显示，6 份供试品溶液中4 个待测物质的RSD 值分别为1.18%、1.47%、3.02%、1.86%，表明该方法重复性较好。

（5）加样回收率试验 取同一批已知含量的［180℃（30 min）］黄芩炭饮片粉末0.15 g 共12 份，分别吸取低、中、高浓度对照品溶液适量（使得其质量分数分别相当于原黄芩样品中的50%、100%、150%），根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和RSD，平均加样回收率分别为 103.22%、99.03%、99.59%、95.89%，RSD 分别为 2.18%、3.33%、1.66%、3.67%，表明方法的准确性较好，见表2。

采集气体样品的同时，用数字温度计（Model 2455，Yokogawa，Japan）记录气温、箱温和土温，用直尺记录田面水层厚度，用 DMP-2数字式氧化还原电位计测定土壤Eh。每隔8~14天采集1次土样。土样用2 mol·L-1 KCl溶液浸提（土水质量比为1∶5），由 Skalar流动分析仪（Skalar，Netherlands）测定浸提液中NO3¯-N和NH4+-N浓度。水稻收获时，按试验小区分别收割、脱粒、晾晒、适当筛除秕粒后称重，计算水稻产量。

2.3 MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点等位基因分布情况 湖口县汉族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G等位基因分布与其他地区的差异基本与相应的基因型分布差异一致，其中MTHFR C677T位点T等位基因的频率整体上呈现随纬度降低而降低的趋势，MTHFR A1298C位点C等位基因的频率则整体上呈现相反的趋势。见表4。

表2 4 种成分的加样回收率考察结果Tab. 2 Results of recovery of 4 components in 19 batches of samples

2.3.1 黄芩炭饮片中黄酮类成分转化规律分析将19 批不同炮制程度黄芩炭饮片的含量测定结果进行作图对比分析，见图2。可以明确黄芩炭在炮制过程中黄芩素、汉黄芩素含量呈先上升后下降的变化模式，黄芩苷、汉黄芩苷在炒制时间短时有轻微上升趋势，但整体呈单向递减的变化模式。当饮片炒制条件为150°C（50 min）、180°C（30 min）、210°C（20 min）时，黄芩素、汉黄芩素含量达到最高，其后开始下降，存在拐点现象，表明在炮制过程中糖苷类成分向相应苷元类成分发生了转化。

表3 黄芩炭样品中黄酮类成分含量测定结果Tab. 3 Contents of flavonoids in Scutellariae Radix Carbonisatum

表4 黄芩炭浸膏中黄酮类成分含量测定结果Tab. 4 Content determination of Scutellariae Radix Charcoal extracts

2.3 基于PCA 对黄芩炭中黄酮类成分含量转化及转移率分析

2.2.5 黄芩炭及浸膏中黄酮类成分的含量测定按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC测定分析，其饮片含量检测数据见表3，以浸膏冻干粉的质量与黄芩炭样品的投药量之比为出膏率，其大小及含量见表4。在以往黄芩炭研究中发现黄酮类成分含量单位大多用质量分数、百分含量等表示，为了更直观地观察和比较四种黄酮类成分的转化规律，故将含量单位换算成摩尔质量分数进行分析。从测定结果可知，炮制程度不同，糖苷到苷元的转化程度不同。

图2 黄芩炭饮片中黄酮类成分变化趋势图Fig. 2 Trend diagram of flavonoids composition in Scutellariae Radix Charcoal

（2）精密度试验 取同一混合对照品溶液，连续进样6 次，每次10.0μL，记录各待测成分的色谱峰面积。结果显示，4 个待测物质峰面积的RSD为0.12%、0.17%、0.13%、0.11%，均小于0.50%，表明仪器的精密度良好。

图3 黄芩炭样品主成分得分图Fig. 3 Plot of principal component scores of Scutellariae Radix Charcoal

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，摇匀，配制成质量浓度分别为0.434 4 mg/mL、0.513 2 mg/mL、0.298 0 mg/mL、0.451 2 mg/mL 的混合对照品溶液，备用。

应掌握小若虫高峰期，每百丛虫量达1500头以上时施药防治。药时应注意先从田的四周开始，由外向内，实行围歼。喷药要均匀周到，注意把药液喷在稻株中、下部。使用扑虱灵可湿性粉剂20克-25克，或25%优乐得可湿性粉剂20克-25克，或20%叶蝉散乳油150毫升，任选一种，对水75千克-100千克常规喷雾，或对水5千克-7.5千克低量喷雾。

图4 黄芩炭样品主成分载荷图Fig. 4 Principal component loading diagram of Scutellariae Radix Charcoal

2.3.2 黄芩炭浸膏中黄酮类成分转化规律分析 19批黄芩炭浸膏中黄酮类成分含量的变化趋势见图5。从含量大小可知其转化规律不完全等同于饮片，即浸膏中苷类成分整体高于饮片中含量，苷元类成分整体低于饮片中成分，因此其糖苷与苷元的比例不相同。

图5 黄芩炭浸膏中黄酮类成分变化趋势图Fig. 5 Trend diagram of flavonoids composition in Scutellariae Radix Charcoal extracts

同样以四种黄酮类成分含量进行主成分分析，见图6、图7。主成分分析结果表明PC1 和PC2 可以解释说明99.8%的原始信息。图6 黄芩炭浸膏的得分图表明不同黄芩炭浸膏的黄酮类成分也同样具有明显差异，可大致分为A、B、C 三类，且由图7 可知，浸膏中苷元类成分变化规律一致，苷类成分变化一致。其中150°C（40 min）的饮片样品属于A 类，对应浸膏分类为B 类，180°C（40 min）的样品相比于饮片得分图中位置也发生改变，均可能是由于煎煮过程中有效成分的转移变化导致的[11]。

在对养路机械进行点检管理时期，管理人员的专业能力对养路机械的检测效果有决定作用。因此，在对养路机械进行点检时，应聘请经验丰富的点检管理人员实施具体的点检管理工作，并对专业水平有待提高的人员进行能力培训，促进工作人员树立较强的管理意识，进而推动养路机械的点检管理工作水平的提升。

图6 黄芩炭浸膏主成分得分图Fig. 6 Plot of principal component scores of Scutellariae Radix Charcoal extracts

图7 黄芩炭样品主成分载荷图Fig. 7 Principal component loading diagram of Scutellariae Radix Charcoal extracts

综上所述，利用PCA 可以将不同炮制程度的黄芩炭饮片及浸膏进行综合评价，同时明确糖苷、苷元的转化规律及变化模式，为今后炮制机制的研究提供依据。

2.3.3 黄酮类成分从饮片到浸膏的转移率分析为了明确四种成分的转移情况，对其转移率进行计算并分析，见图8。其中，转移率（%）=（浸膏中各黄酮类成分含量×出膏率）/饮片中各黄酮类成分含量[12-13]。由图8 可知，炮制程度会明显影响黄芩炭中有效成分的转移率，即随着炮制程度的增加，浸膏中四种成分的转移率均呈下降趋势，同时也说明了炮制程度越深，四种成分从饮片中越不容易煎煮出来。

图8 黄芩炭饮片-浸膏四种黄酮类成分转移率变化图Fig. 8 Transformation and transfer of flavonoids in Scutellariae Radix Charcoal

3 讨论

本研究发现黄芩炭化过度会明显降低浸膏的出膏率即有效物质总量。课题组前期通过测定不同炮制程度的黄芩炭饮片中醇溶性浸出物的含量，发现在同一炮制温度下，其浸出物含量随炮制时间的增加而逐渐下降，且当180°C 炮制40 ～ 60 min 以及210°C 炮制30 ～ 60 min 时，其浸出物的含量均下降至10%以下。由于浸膏是经过多次煎煮得到的，其出膏率大小取决于浸膏质量，进而受炮制程度的影响。这也揭示了不同炮制程度的黄芩炭浸膏中四种黄酮类物质的总量是逐渐降低的，再次证明了黄芩炭在上述炮制温度与时间下已炮制过度。因此本研究所用的炮制品同时包含了炮制不及、炮制适中、炭化过度三个程度，以更加全面地阐释黄芩炭的炮制过程以及完整合理性。

一般认为中药经炒制后利于有效成分的溶出，但是本研究发现随着炮制程度增加，黄芩炭中四种有效成分的转移率均降低。根据相关文献，推测黄酮类成分转移率下降的可能原因包括：（1）黄芩在高温炒制过程中黄酮苷的糖苷键断裂生成相应的黄酮苷元与α-D-吡喃葡萄糖醛酸，α-D-吡喃葡萄糖醛酸及其进一步的水解产物、鞣质类等分解出的没食子酸等小分子有机酸使水溶液pH 值降低，而黄芩苷、黄芩素等在酸性条件下溶解度变低[14]；（2）万鹏等[15]研究表明灵芝多糖可以促进黄芩苷在水中的溶解，随着黄芩炭炮制程度的加深，淀粉、纤维素、半纤维素等多糖类成分逐步分解，可能导致黄酮类成分溶解度降低、转移率降低；（3）黄芩炭炮制程度增加时，形成的焦炭结构[16]吸附力提高，进而影响黄酮类成分的溶出和转移率。这表明虽然黄芩炭浸膏中糖苷与苷元类成分的变化趋势与饮片类似，但是溶解度与转移率的变化使黄芩炭浸膏中苷元类成分的含量拐点可能不同于黄芩炭饮片。

吸收是发挥药效的前提，中药汤剂虽以液体形式使用, 但其中成分也多数通过吸收而进入机体发挥疗效，现有基础认为黄酮苷元类比糖苷类更容易吸收[17-18]，因此初步推测黄芩素、汉黄芩素等苷元类成分含量增加可以加快药效物质吸收，进而影响药效，提示药动学参数可以成为黄芩炭的质控指标之一，但仍需进一步进行动物水平的药效实验加以验证与完善。

观察组急性阑尾炎合并糖尿病患者并发症发生率2.22%较对照组低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

4 结论

本研究明确了炮制程度对黄芩炭四种黄酮类成分之间转化、转移的影响规律，证明了黄芩的炒炭过程中主要是糖苷键的断裂即糖苷转化为苷元，同时指出成分转移率随炮制程度的加深逐渐下降。因此综合饮片及浸膏含量可知苷元含量拐点处达到最大转化，且成分的转移率相对较高，初步认为拐点处条件是黄芩炭的炮制终点，为其质量控制、炮制机理的研究以及临床应用提供一定的理论参考。