基于AHP-熵权法结合色差原理优选猪心血丹参炮制工艺

于银萍，李 林*，张 婷，刘欢欢，王 敏，陆兔林，叶明磊，刘明贵，徐葱茏

（1. 南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210046；2. 江西景德中药股份有限公司，江西 景德镇 333302)

猪心血丹参为孟河医派临方特色炮制品，临床上主要用于治疗心神不宁、心悸怔忡及痰迷心窍等证，历代医家认为猪心血为养心药之向导，能增强丹参入脑补血安神之功[1]。最早临床应用猪心血的是华佗，其思想影响着大批孟河医家，为增强丹参入脑补血安神之功，孟河医家创新使用猪心血炮制丹参。孟河医家巢崇山写到：“治疗素体血亏，肝脾不调，经水色黑而少，纳减形瘦，心中空洞，时有不能自主之状，夜不能寐，方中用猪心血拌炒丹参”[2]。清代凌奂编撰的《本草害利》[3]中记载：“猪心血拌补心药丹参之类，用作补心药之向导，盖取以心归心，以血导血之意”。随着孟河镇从医者越来越多，部分医家到上海行医，影响了上海的炮制技术[4]，自1959 年第一版《上海市中药饮片炮制规范》起到2018 年第七版均收录猪心血丹参的炮制方法。

2018 年版《上海市中药饮片炮制规范》[5]收载猪心血丹参，其炮制工艺为：“取丹参用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽，干燥。每100 g 丹参，用鲜猪心3 只取血，加黄酒30 g，混匀”，但炮制工艺并不明晰，3 只鲜猪心血量不稳定，干燥方式及时间等均未具体说明，这些原因限制了猪心血丹参工业化生产。为使猪心血丹参更好地传承、发展，故开展猪心血丹参炮制工艺与色泽鉴别标准的相关研究，通过规范其炮制工艺，建立生产工艺技术与操作规程，为后续深入研究猪心血丹参炮制机理奠定基础。

1 仪器与材料

岛津LC-20AD 型高效液相色谱仪（ 日本SHIMADZU 公司）；MS-105D 型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR124CN 型万分之一电子天平［（奥豪斯仪器（上海）有限公司）］；KQ-500B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H1650-W 型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达有限公司）。

丹酚酸B（ 批号：SBJ-10266，纯度≥98%，南京森贝伽生物科技有限公司）；丹参酮 ⅡA（ 批号：T817771，纯度≥98%，北京华威锐科化工有限公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸［色谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙醇（分析纯，南京晚晴化玻仪器有限公司）。

丹参饮片购于上海上药华宇药业有限公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎的加工品；黄酒购于绍兴市绍一缸酒业有限公司（批号：GB/T13662）；猪心血为南京大厂欣乐肉类食品中心定点屠宰场现场提供。

2 方法

2.1 猪心血丹参的制备

结合前期单因素实验，对猪心血量、黄酒量、烘干温度、烘干时间进行正交实验。取净丹参100 g，按L9（34）正交试验表分别加入不同量猪心血和黄酒拌匀，闷润至液体吸尽，在设定温度下烘干（水分＜13%），到达规定时间后取出晾凉，即得。炮制工艺因素水平见表1。评价指标选择丹酚酸B 含量、丹参酮 ⅡA 含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物进行分析。

表1 猪心血丹参炮制工艺正交试验设计Tab. 1 Orthogonal experimental design of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma processing process

2.2 水溶性浸出物测定 依据2020 年版《中国药典》水溶性浸出物测定法（通则2201）项下的冷浸法测定[6]。

2.3 醇溶性浸出物测定 依据2020 年版《中国药典》醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定[6]，用乙醇作溶剂。

2.4 丹参酮 ⅡA、丹酚酸B 含量测定

2.4.1 丹参酮 ⅡA 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流 动 相A 为 乙 腈，B 为0.02%的磷酸溶液；柱温：20 ℃；检测波长：270 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱程序（0 ～ 6 min，61%A；6 ～ 20 min，61%→90%A；20 ～ 20.5 min，90%→61%A；20.5 ～ 25 min，61%A）[6]。丹酚酸B 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%的磷酸溶液（22 ∶78）为流动相；柱温：20 ℃；检测波长：286 nm；流速：1.2 mL/min；进样量：10 μL[7]。HPLC 图见图1。

图1 各成分HPLC 图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituent

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参酮 ⅡA 对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成质量浓度为20 μg/mL 的溶液，即得丹参酮 ⅡA 对照品溶液。精密称取丹酚酸B 对照品适量，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液配制成质量浓度为0.11 mg/mL 的溶液，即得丹酚酸B 对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末（过三号筛） 0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹参酮 ⅡA 供试品溶液。精密称取本品粉末（过三号筛）0.15 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水（8 ∶2）混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，用甲醇-水（8 ∶2）混合溶液补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，移至10 mL 容量瓶中，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹酚酸B供试品溶液。

2.4.4 标准曲线绘制 精密称取丹参酮 ⅡA 对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇分别配制成质量浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL 的溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程Y= 54 813X，r=0.999 0，在2.5 ～ 80.0 μg/mL 范围呈良好的线性关系。精密称取丹酚酸B 对照品适量，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液分别配制成质量浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL 的溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程，Y= 9 974.7X，r= 0.999 9，在12.5 ～ 400.0 μg/mL 范围呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样6次，按“2.4.1”项下条件测定，丹参酮 ⅡA、丹酚酸B的RSD分别为0.12%、0.24%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性考察 精密称取同一样品6 份，按“2.4.3”项下方法制备。按“2.4.1”项下条件测定，丹参酮 ⅡA、丹酚酸B 的RSD 分别为0.18%、0.70%，表明方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验 取同一供试品溶液在 0、2、4、8、12、18、24 h 分别测定色谱峰面积，丹参酮 ⅡA、丹酚酸B 的RSD 为0.30%、0.82%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.8 加样回收率试验 取已知含量测定的同一猪心血丹参（丹参酮 ⅡA 的质量分数为0.154 6%） 粉末6 份，每份约0.3 g ，精密称定。加入丹参酮 ⅡA对照品约0.463 8 mg，按“2.4.1”项下色谱条件测定。取已知含量测定同一猪心血丹参（丹酚酸B 的质量分数为5.600%） 粉末6 份，每份约0.15 g，精密称定。加入丹酚酸B 对照品约8.400 0 mg，按“2.4.1”项下色谱条件测定。丹参酮 ⅡA、丹酚酸B 的回收率分别为97.55%、100.02%，RSD 分别为0.45%、0.39%，见表2，说明该方法有较好的准确性。

表2 加样回收率试验（n = 6）Tab. 2 Result of recovery test（n = 6）

2.5 熵权法-层次分析法计算综合评分

2.5.1 熵权法确定各指标权重 熵权法即在综合考虑各个因素所提供信息上，根据各项指标所提供的信息来确定权重。信息量越大，所得熵越小，对评价的贡献度越大，权重就越大[8]。指标权重（Wj）[9]按下式进行计算：指标标准化值（Yij） =（实测值-最小值） /（最大值-最小值）

2.5.2 层次分析法确定各指标权重 ①建立层次结构模型：结合影响猪心血丹参炮制工艺的指标等因素，建立了三个层次的结构模型。第一层为目标层，即优选猪心血丹参炮制工艺；第二层为指标层，即影响猪心血丹参炮制工艺的指标；第三层为方案层，即正交实验优选猪心血丹参炮制工艺。②构造成对比矩阵。③计算权向量并做一致性检验。④计算组合权向量并做组合一致性检验。查阅相关文献，对各指标按照不同的重要程度进行排序。

注：i , j 即第 j 项指标在第i 个方案中占该指标的比重；Pij 即该指标的变异大小；Sj 为一组数据的信息熵；Pij = 0 时，定义Si = 0; k 为指数个数。

2.5.3 熵权法-层次分析法计算复合评分 按下式计算熵权法-层次分析法综合权重（Hj）[10]，wj、rj为熵权法、层次分析法所得权重系数。

2.6 色度值与指标性成分相关性研究

采用分光测色仪对不同炮制程度的猪心血丹参进行测色，以期为猪心血丹参生产在线检测提供参考。

按正交试验优选的最佳工艺进行炮制，但烘干时间从1 ～ 8 h，设置8 个点。对其颜色进行测定，每个样品平行测定3 次，取平均值，饮片粉碎过三号筛，使用CM5 分光测色仪观察脉冲下氙弧灯（D65ф3 毫米）的视角设置为10 点。校准后，选择SCE 模式。

2.6.1 精密度试验 取烘干时间4 h 的猪心血丹参饮片粉末适量，按上述条件进行颜色测定，连续测定6 次。L*，a*，b*的RSD 分别为0.01%、0.03%、0.02%，表明该仪器精密度较好。

2.6.2 重复性试验 取烘干时间4 h 的猪心血丹参饮片6 份粉末适量，按上述条件进行颜色测定，L*，a*，b*的RSD 分别为0.20%、0.40%、0.29% ，表明该方法重复性良好。

2.6.3 稳定性试验 取烘干时间4 h 的猪心血丹参饮片粉末适量，按上述条件进行颜色测定，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进行测定，L*，a*，b*的RSD分别为0.46%、1.61%、1.81%，表明该方法在24 h 内稳定性良好。

3 结果

3.1 熵权法-层次分析法计算复合评分

将得到的结果先采用熵权法，计算权重，丹酚酸B、丹参酮 ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的权重分别为0.49、0.14、0.20、0.17。再采用层次分析法对各指标按照重要程度进行排序。排列结果为丹酚酸B =丹参酮 ⅡA ＞水溶性浸出物=醇溶性浸出物，然后采用和积法并进行归一化，得到结果为丹酚酸B、丹参酮 ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的权重0.33、0.33、0.17、0.17。并进行一致性比值（CR）计算，CR = 0（ ＜0.1）说明矩阵合理有效，权重系数可靠[11]。CR 越大，矩阵一致性越差；CR 为0 说明矩阵具有完全一致性。最后使用AHP-熵权法复合评分计算，丹酚酸B、丹参酮ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的综合权重分别为0.60、0.18、0.12、0.10。综合权重计算综合评分：Z = 0.60×100×（ 丹酚酸B 含量/丹酚酸B 含量最大值）+ 0.18×100×（丹参酮Ⅱ A 含量/丹参酮 ⅡA 含量最大值）+ 0.12×100×（水溶性浸出物/水溶性浸出物最大值）+ 0.10×100×（醇溶性浸出物/醇溶性浸出物最大值） 。最后进行方差分析，得出炮制猪心血丹参最佳工艺，测定结果见表3、表4。

表3 L9（34）正交试验结果分析Tab. 3 Analysis of L9（34） orthogonal test results

表4 方差分析结果Tab. 4 The results of the analysis of variance

结果显示，猪心血丹参炮制工艺仅因素A 对AHP 综合评分存在显著影响（P＜0.05），熵权法所得各因素对综合评分无显著影响（P＞0.05）。各因素对AHP-熵权法综合评分影响顺序为A＞C＞D＞B，最佳工艺为A1B2C1D1，即猪心血量20 g/100 g，黄酒量30 g/100 g，烘干温度50 ℃，烘干时间4 h。

3.2 猪心血丹参最佳炮制工艺验证试验

称取丹参饮片100 g，按上述最佳炮制工艺炮制3 批猪心血丹参，按“2.2”“2.3”“2.4”项下方法进行含量测定，结果见表5。由结果可知，优选所得炮制工艺制备猪心血丹参饮片稳定、可行。故该工艺可作为生产时炮制猪心血丹参条件。

表5 猪心血丹参最佳炮制工艺验证试验结果（%，n = 3）Tab. 5 The best process verification results of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（%，n = 3）

3.3 猪心血丹参样品颜色测定

对不同炮制程度猪心血丹参饮片进行颜色测定，见表6、图2。

图2 猪心血丹参不同炮制程度色度值变化趋势图Fig. 2 Trend chart of color values of different degrees of preparation of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

表6 猪心血丹参饮片含量测定及色度值结果（n = 3）Tab. 6 Determination of the content and color value of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（n = 3）

3.4 色度测定结果分析

3.4.1 炮制时间与色泽相关性分析 将所得实验结果用SPSS 26.0 软件进行相关性分析，Pearson 相关系数显示，L*与炮制时间（2 ～ 8 h）呈正相关，相关系数为0.944（P＜0.01）；a*与炮制时间（2 ～ 8 h）呈负相关，相关系数为-0.931（P＜0.01）；b*与炮制时间（2 ～ 8 h）呈负相关，相关系数为-0.79（3P＜0.05）。

3.4.2 色泽与含量相关性分析 将所得含量测定实验结果输入SPSS 26.0 软件进行相关性分析，Pearson 相关分析见表7。

表7 猪心血丹参色泽与含量的相关性分析结果Tab. 7 Results of correlation analysis between the color of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and the time and content of preparation

3.4.3 建立色度值参考范围 将最佳炮制工艺所得猪心血丹参饮片的色度值作为基准上下浮动20%得到L*，a*，b*值范围为50.19 ～ 75.29、8.82 ～ 13.22、16.10 ～ 24.14。只有L*值和b*值范围可以较好的区分猪心血丹参炮制不及和炮制适中的样品，所以选择L*值和b*值范围确定猪心血丹参色度值参考范围。以此来确定猪心血丹参饮片在炮制过程中是否达到标准。

4 讨论

现代研究发现丹参炮制成猪心血丹参后，其水溶性成分与猪心血的肽类结合可以提高入血入脑的浓度[12]。脂溶性成分可以与其中的氨基酸或短肽形成盐类，增加溶解度，从而使其功效增加[13]。这些复合物目前无法进行准确的含量测定，故在丹酚酸B、丹参酮 ⅡA含量的基础上增加水溶性浸出物和醇溶性浸出物作为评价指标。层次分析法（AHP）为主观赋值法，熵权法为客观赋值法，两者进行综合评分，所得结果更加合理。猪心血丹参在炮制过程中，温度要适宜，温度太低、烘干时间太短，水分无法达到要求，则会使猪心血丹参霉变速度加快；温度太高、烘干时间太长，则会破坏猪心血丹参中有效成分，丹酚酸B 降解速度随温度升高而增大[14]。

由于饮片生产企业工业化生产烘干设备温度控制误差较大，设备不同部位温度区别明显，导致小试生产工艺无法顺利移至工业化生产，为了使企业批量生产时得到质量合格的饮片，采用分光测色仪对猪心血丹参不同炮制程度饮片进行颜色测定，研究猪心血丹参饮片颜色、含量与炮制时间的关系。以期在批量生产时通过颜色来判断猪心血丹参饮片炮制程度。经研究发现猪心血丹参炮制程度不同，其颜色也不同，对其含量和颜色进行相关性分析，结果显示炮制时间与颜色显著相关，即随着炮制时间延长，L*升高，a*和b*降低。L*值范围和b*值范围可以较好的区分猪心血丹参炮制不及和炮制适中的饮片，故选择L*值范围和b*值范围来衡量其是否合格。

5 结论

本研究通过AHP-熵权法和色差原理建立猪心血丹参的炮制工艺，经验证该炮制工艺条件稳定可行，可为规范化生产猪心血丹参奠定基础。但针对猪心血丹参饮片质量标准不完善的问题，有待进一步研究，以期为猪心血丹参的临床应用提供科学参考。