巨核细胞在ITP 患者中的诊断价值及治疗后HPA 的表达效果

冯于，刘学文，刘明君，张坤，卓丽霞

1.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院血液内科，内蒙古包头 014030；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院血液内科，内蒙古包头 014010

原发性免疫性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytoenia purpura,ITP)是临床上因血小板计数减少引起的最常见的出血性疾病，主要与体液免疫和细胞免疫紊乱有关[1-3]。ITP 成人发病率为5/10万～10/10 万，60 岁以上老年人是高发群体，育龄期女性略高于同年龄组男性[4]。因其发病机制复杂，临床表现与治疗效果各不相同[5]。ITP 主要表现为皮肤黏膜出现瘀点、瘀斑、紫癜，口腔血疱，甚至出现视物模糊、眼底出血等症状[6-8]。约有半数ITP 患者会出现疲乏状态，部分患者会合并记忆力减退和注意力不集中等情况[9]。HPA 是血小板膜糖蛋白上的特异性抗原表位，其基因呈现高度多态性[10]，诱导内部隐性表位暴露，巨噬细胞识别后上调刺激分子，引起一系列自身免疫反应，破坏血小板，巨核细胞计数增高及生长、成熟障碍，致使血小板不足而引起ITP。临床分析HPA 与ITP 相关性的研究较多，对ITP 治疗后HPA 的表达的研究较少。故本研究选取2020 年11 月—2021 年11 月包头医学院第一附属医院和包头医学院第二附属医院收治的ITP患者57 例作为研究对象，通过形态学角度分析罹患ITP 时的巨核细胞（megakaryocyte,MK）的变化，并经艾曲波帕治疗后，观察HPA 的表达及对疗效的预测作用，为临床医师提供诊治资料。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的ITP 患者57 例（ITP 组），另选取同期正常者56 名（正常组）。ITP 组男21 例，女36例，平均年龄（52.87±3.36）岁。正常组男22 例，女34 例，平均年龄（53.04±3.40）岁。两组一般资料对比，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合成人ITP 的诊断标准[4]：至少连续2 次血常规检查显示PLT 计数减少，外周血涂片镜检血细胞形态几乎正常。PLT 计数<100×109/L；患者皮肤出现瘀斑、出血点或脏器及黏膜发生出血等；MK 计数正常或增加，伴成熟障碍；家属签署知情同意书；临床资料完整。排除标准：系统性红斑狼疮者；先天及自身免疫性疾病、再生障碍性贫血者；具有精神类疾病或沟通有障碍者。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 口服艾曲波帕（进口药品注册证号H20170387），25 mg/d，依据病情及PLT 调整药物口服剂量。

1.3.2 观察方法 使用巨核细胞流式检测抗体试剂，选取BM 取材、染色、涂片良好的标本进行MK 标化记数。在涂片体尾交接处按顺序用油镜分类20～40个MK，对>40 个MK 或<20 个MK 者根据其实际数目计算。巨核细胞分类包含原幼、颗粒、裸核、产板4型，并计算各型所占比例。采用定量积分、统计方法对MK 退行性变、颗粒及胞浆进行分析。

1.3.3 HPA 采集 ①仪器：使用ELISA 抗HPA 试剂和加样板，采用间接免疫荧光法。阴性对照选择自身抗体阴性（人源），阳性对照选择抗血小板抗体IgG阳性（人源）。②方法：取患者1.2～2.0 mL 乙二胺四乙酸抗凝血，离心处理并分离富血小板血浆，磷酸盐缓冲液、吐温缓冲液按1∶10 稀释血浆，并取出30 μl 血浆加入样板反应区，封盖在18～25 ℃下温育（期间需滴入25 μl 异硫氰酸荧光素标记的抗人球蛋白）30 min，避光操作，冲洗反应膜片，浸泡5 min，用吸水纸吸干载片水分，与二抗相应区域完全接触，再次重复温育-浸泡-吸水等操作，盖玻片嵌入载片。最后显微镜下观察荧光强度，并比较阴、阳性结果。

1.4 观察指标

①统计ITP 组、正常组MK 计数及形态分类情况。形态分类包含原幼型、颗粒型、产板型、裸核型。②符合短期有效率评定标准[11]，包括完全反应、有效、激素依赖和无效。完全反应：没有出血，治疗后PLT 计数≥100×109/L；有效：没有出血，治疗后PLT 计数≥30×109/L，提升2 倍基础PLT 数量；激素依赖：防止出血，持续用药使PLT 计数≥30×109/L；无效：发生出血，治疗后PLT 计数<30×109/L 或未能提升2 倍基础PLT 数量。疗效评估需测定2 次，且应间隔7 d 以上。

1.5 统计方法

采用SPSS 25.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料用（）表示，组间差异比较采用t检验；计数资料用频数和百分比（%）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MK 分类结果对比

ITP 组原幼型及颗粒型MK 计数均高于正常组，产板型MK 计数低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组MK 分类结果对比[()，个/1.5×3.0 cm]

表1 两组MK 分类结果对比[()，个/1.5×3.0 cm]

2.2 两组MK 定量积分结果对比

ITP 组胞浆量、退行性变量高于正常组，颗粒量（伴有成熟障碍）低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组MK 定量积分结果对比 [()，个/1.5×3.0 cm]

表2 两组MK 定量积分结果对比 [()，个/1.5×3.0 cm]

2.3 MK 形态学诊断价值分析

颗粒型MK 敏感度、特异度为96.30%、60.00%，AUC 面积为0.913；原幼型MK 敏感度、特异度为94.74%、60.00%，AUC 面积为0.908；产板型MK 敏感度、特异度为94.34%、63.64%，AUC 面积为0.902；颗粒量敏感度、特异度为91.07%、62.50%，AUC 面积为0.893；退行性变量敏感度、特异度为88.89%、57.14%，AUC 面积为0.862；细胞浆量敏感度、特异度为88.67%、60.00%，AUC 面积为0.858。MK 形态学诊断ITP 的ROC 曲线，见图1。

图1 MK 形态学诊断ITP 的ROC 曲线

2.4 ITP 患者不同HPA 的短期有效率对比

HPA>1∶10 组短期有效率（100.00%）高于<1∶10组（90.00%）、1∶10 组（89.29%），差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 ITP 患者不同HPA 的短期有效率对比

3 讨论

ITP 属于自身免疫性疾病，因ITP 患者MK 常处于增多并伴有成熟障碍情况，故巨核细胞形态学变化是诊断ITP 的重要指标之一[12]。

本研究中ITP 组原幼型巨核细胞MK 计数（12.15±1.30）个/1.5×3.0 cm 高于正常组，颗粒型MK计数（69.78±14.07）个/1.5×3.0 cm 高于正常组，产板型MK 计数（9.70±7.15）个/1.5×3.0 cm 低于正常组（P<0.001）。ITP 组胞浆量（2.39±0.52）个/1.5×3.0 cm高于正常组，退行性变量（1.42±0.43）个/1.5×3.0 cm高于正常组，颗粒量（伴有成熟障碍）（1.88±0.17）个/1.5×3.0 cm 低于正常组（P<0.001）。颗粒型MK、原幼型MK、产板型MK、颗粒量、退行性变量、细胞浆量的AUC 面积分别为0.913、0.908、0.902、0.893、0.862、0.858。说明通过MK 形态学变化诊断ITP 具有重要意义。ITP 患者MK 计数、胞浆量及退行性变量明显增加，颗粒量减少并伴有成熟障碍，主要因祖细胞受淋巴细胞产生的白介素和单核-巨噬细胞集落刺激因子（M-CFS）等活性物质的调控作用。加之自身抗体介导增加PLT 破坏，使巨核细胞出现生长、成熟障碍，致使PLT 计数降低。周红琳等[13]研究中PITP 组原幼型MK 计数（44.13±59.79）个/1.5×3.0 cm、颗粒型MK 计数（48.84±85.26）个/1.5×3.0 cm 均高于正常组（5.78±1.00）、（53.49±10.77）个/1.5×3.0 cm，产板型MK计数（3.52±6.48）个/1.5×3.0 cm低于正常组（36.87±11.25）个/1.5×3.0 cm（P<0.05），裸核型（9.62±11.06）个/1.5×3.0 cm 与正常组（10.76±4.17）个/1.5×3.0 cm 差异无统计学意义（P>0.05），且伴有巨核细胞成熟障碍。说明巨核细胞可诊断不同类型的ITP。

本研究中HPA>1∶10 组短期有效率（100.00%）高于HPA<1∶10 组（90.00%）、1∶10 组（89.29%）（P<0.05）。说明HPA 阳性率高的患者经艾曲波帕治疗后，治疗效果良好。因艾曲波帕是口服TPO 受体激动剂[14]，与血小板生成素受体（MPL）跨膜区H499残基结合，加速MK 增殖分裂，产生并释放大量功能正常的血小板至外周循环[15-16]。诸多临床试验反应率高达80%左右，且未出现明显的不良反应，适宜长期应用。黄月婷[17]使用艾曲波帕治疗75 例成人ITP 患者，起始剂量分别为25 mg/d、50 mg/d、后续根据PLT 水平增至75 mg/d，治疗后首次PLT≥30×109/L的中位时间是14 d，54.67%患者在14 d内起效。说明艾曲波帕起效快。治疗总有效率为81.33%，32.00%的患者持续用药≥6 个月仍有效，其中10 例患者停药后≥6个月PLT仍维持>30×109/L。说明艾曲波帕持续用药效果更佳。50 mg/d 或75 mg/d 组疗效均高于25 mg/d，既往TPO 用药史、血小板抗体表达、巨核细胞数不影响药物疗效。多数患者停药后PLT 维持时间较短。说明既往用药史不影响艾曲波帕治疗效果，但需考虑长期用药以维持PLT 水平。González-López TJ 等[18]给予老年ITP 患者艾曲泊帕治疗，治疗总缓解率为82%，治疗3 个月及6 个月时的总缓解率分别为72%及61%，安全性较高。综合各项研究表明艾曲波帕起效快，HPA>1：10 患者的治疗效果更佳，同时不受用药史及治疗史影响，安全性高，但需长期用药提高治疗效果。

综上所述，骨髓巨核细胞形态学变化可有效诊断ITP，ITP 患者服用艾曲波帕治疗后，促进巨核细胞增殖、成熟，增加血小板计数，且HPA>1：10 患者的疗效更佳。本研究样本量较少，且未进行不同治疗方式对比，未来可增加样本量、不同治疗方式的疗效进行对比，为正确诊疗ITP 及预后效果提供参考依据。