基于智能感官和气相色谱-质谱联用技术研究食盐添加量对风干肠风味特征的影响

李永杰，唐 月，李慧瑶，孔保华，王见钊，任 静，陈 倩

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

食盐是传统肉制品加工中必不可少的成分，其既能增加肌原纤维蛋白的溶解性，改善肉制品的保水性和加工特性，又可降低水分活度（aw），抑制腐败微生物生长代谢，提高产品的安全特性[1-2]；另外，NaCl对传统肉制品的风味形成也有着重要作用，一方面具有咸味和增鲜作用，另一方面还可影响蛋白质和脂质等营养物质的水解和氧化，进而影响相应风味物质的产生[3-5]。但长期过量食用高钠盐食品会增加患高血压、心血管疾病、骨质疏松、中风、慢性肾脏疾病、胃癌和肥胖等诸多疾病的风险[6-8]。为此，世界卫生组织和《中国居民膳食指南》分别于2012年和2016年提出成人每日NaCl摄入量应不高于5 g和6 g，但目前我国人均每日食盐摄入量在12 g左右[9-10]。而由食用肉制品而摄入的食盐通常占居民摄入食盐的20%～30%[11]。风干肠作为一种传统发酵肉制品的代表，因其独特的口感和风味而深受东北地区消费者的欢迎。但是为了保证产品的安全性及加工特性，在风干肠加工时通常加入2.5% NaCl，历经发酵风干后的产品NaCl质量分数会高达3.3%～4.2%[1]。因此，降低风干肠NaCl含量的同时又可保证产品的品质及安全特性是亟需解决的问题。

目前减盐策略主要包括4种：直接减盐[1,12]、使用NaCl替代物和风味增强剂[13-14]、改变NaCl颗粒的大小和形态[15]以及使用非热加工技术[16]，其中直接减盐法相比与其他方法较为简单直接，且符合天然、绿色和无添加的“清洁标签”理念[17]，但该方法会影响食品原有的特征风味和食用期限。因此，在减盐的同时尽量保证产品的品质特性至关重要。气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术是食品中常用的挥发性、半挥发性物质定性和定量方法；电子鼻和电子舌是仿生智能感官技术，主要用于食品中的气味和滋味特征分析[18]。这些仪器具有灵敏度高、选择性好和客观准确等优点，三者相结合使用能够实现对食品风味快速、准确和相补的分析效果，近年来已被应用到红肠[19]、熏鸡腿[20]、金鲳鱼鱼片[21]、烤咖啡豆[22]和苹果[23]等多种食品的风味分析。因此，本研究运用智能感官技术结合GC-MS技术研究不同NaCl添加量（2.50%、2.00%、1.75%和1.50%）对风干肠的风味特征的影响，以期为减盐风干肠的开发及品质提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后臀肉、猪背脂、肠衣、食盐、大曲酒、味素、淀粉、香辛料 市购；亚硝酸钠（食品级） 天津市 福晨化学试剂厂；葡萄糖（食品级） 河南万邦实业有限公司。

1.2 仪器与设备

JD500-2电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限 公司；AL-104精密电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）设备有限公司；DHG-9000电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；DELTA320 pH计 美国Mettler Toledo公司；HWS-70BX恒温恒湿箱 天津市泰斯特仪器有限公司；GC-3L小型灌肠机 瑞安市鸿飞机械有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；SPX-250B-D型振荡培养箱 上海博讯实业有限公司；AquaLab智能水分活度仪 美国Decagon Devices公司；SA402B电子舌 日本Insent公司；PEN3便携式电子鼻气味分析仪 德国Airsense公司；GCMS-QP2020单四极杆型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 风干肠的制备

共有4 组风干肠处理组，其NaCl添加量分别为2.50%（对照组）、2.00%、1.75%和1.50%。参照Chen Qian等[24]的方法制作风干肠并部分改动，首先，将瘦肉和肥肉用孔径为1.5 cm筛板的绞肉机绞碎，按瘦肥质量比9∶1混合。然后，加入0.01%亚硝酸盐（以瘦肉质量计）、1%玉泉大曲、1%葡萄糖、0.3%味素、5%水和0.8%香辛料（主要包括花椒、橘皮、砂仁、小茴香和丁香等），并按照实验设计加入相应的NaCl混匀。随后灌入猪小肠衣，风干肠长度约15 cm，直径约2.5 cm。然后在温度为（25±2）℃、相对湿度为30%～50%的环境中风干24 h，随后转移到恒温恒湿发酵箱中发酵11 d，温度为（25±2）℃，相对湿度为65%～70%。分别在第0、3、6、9、12天进行取样，测定其水分含量、aw、pH值、乳酸菌总数；在0 d和12 d测定电子鼻、电子舌以及挥发性物质含量，并在12 d对风干肠进行感官评价。

1.3.2 水分含量和aw的测定

水分含量的测定参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法；aw参考陈佳新等[1]的方法，取5 g肉样铺满盒底，然后置于水分活度仪中测定。

1.3.3 pH值和乳酸菌总数的测定

取10.0 g肉样，加入90.0 mL去离子水并振荡混匀，静置30 min后过滤，测定滤液的pH值。乳酸菌总数参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌测定检验》进行测定。

1.3.4 电子鼻的测定

取3.00 g碎肉样于顶空瓶中密封，室温下自然放置1 h使其内部挥发性风味物质平衡，随后使用电子鼻进行测定。测定参数如下：采样时间间隔1 s，预采样时间5 s，自清洗时间100 s，归零时间10 s，进量流量 300 mL/min，样品测定时间90 s。电子鼻配有10个传感器，能对相应敏感气味物质产生响应：W1C（芳烃物质）、W5S（氮氧化合物）、W3C（氮类，芳香组分）、W6S（氢化物）、W5C（芳香烯烃，极性化合物）、W1S（烷类化合物）、W1W（硫化物）、W2S（醇类、醛酮类）、W2W（含硫有机物，芳香组分）和W3S（长链烷烃）。

1.3.5 电子舌的测定

参考Yin Xiaoyu等[19]的方法，并稍作改动。取25.0 g碎肉与125.0 mL去离子水混合并在40 ℃条件下水浴30 min，随后绞肉机低速搅拌1 min，将混合物离心（5 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液过滤，然后对滤液进行电子舌分析。该仪器配有鲜味、涩味、咸味、酸味和苦味5个味觉传感器以及两个参比电极。

1.3.6 挥发性化合物的测定

参照Wen Rongxin等[25]的方法测定。取3.00 g碎肉样和4.0 μL邻二氯苯（内标物）置于顶空瓶，随即密封，并置于45 ℃条件下平衡25 min。平衡后将萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）插入顶空瓶中萃取30 min（45 ℃），然后将萃取头置于GC-MS进样口热解吸（3 min，230 ℃），并通过该仪器对挥发性物质进行分离鉴定。通过比较NIST 14质谱库对挥发性化合物进行鉴定，取相似度大于85%的结果，采用内标法定量，结果以μg/kg表示。

1.3.7 感官评价

参考扈莹莹等[26]的方法，并作适当改动。选取10 名食品专业学生进行评定，将100 ℃熟制20 min的风干肠切成5 mm厚的薄片，通过双盲法7 分制对风干肠评定，感官评价成员每次评定样品前都要漱口。感官评定指标包括气味（干肠特有气味浓郁7 分；有异味或气味不足1 分）、色泽（颜色鲜红7 分；颜色暗淡1 分）、咸味（咸味过重7 分；基本无咸味1 分）、酸味（酸味过重7 分；基本无酸味1 分）、口感（质地干硬7 分；质地柔软1 分）及总体可接受度（可接受性最佳7 分；可接受性最差1 分）。

1.4 数据处理

实验进行3 次重复，每次实验均选3个平行样测定所有指标，结果以±s表示。数据统计分析采用Statistix 8.1软件，显著性分析使用Tukey HSD程序（P＜0.05，差异显著），绘图采用Origin 2019软件绘制。

2 结果与分析

2.1 NaCl添加量对风干肠水分含量及aw的影响

由图1A可知，各组风干肠中水分含量随着发酵的进行均呈降低趋势（P＜0.05）。2.50%、2.00%、1.75%和1.50%处理组中水分质量分数经12 d发酵后分别降至18.53%、19.30%、19.43%和21.66%，这是由于风干肠在发酵过程中风干失水造成的。此外，同一发酵时间不同处理组中水分含量随NaCl添加量的降低而呈不断上升的趋势。除3 d外，2.50%、2.00%和1.75%处理组间差异不显著（P＞0.05），在发酵末期（12 d），1.50%处理组的水分含量均显著大于其他处理组（P＜0.05）。由图1B可知，不同处理组的aw变化趋势与水分含量一致，但并不呈线性关系，与Chen Jiaxin等[27]的研究结果类似。在0 d，NaCl添加量为1.50%的处理组显著高于其他处理组（P＜0.05）。随着发酵的进行，aw不断下降，发酵3 d后，对照组（2.50%）的aw显著低于其他处理组 （P＜0.05），发酵6 d后，处理组的aw均在0.850以下，此时风干肠中大部分微生物和内源酶的活性受到抑制[28]。上述aw的变化主要受发酵过程中水分不断散失以及aw抑制剂NaCl含量增加的影响[1,29]。

图1 NaCl添加量对风干肠发酵过程中水分含量（A）和aw（B）的影响Fig. 1 Effects of different NaCl levels on the moisture content (A) and aw (B) of air-dry sausages during fermentation

2.2 NaCl添加量对风干肠pH值和乳酸菌总数的影响

由图2A可知，在0 d各处理组的pH值在6.38左右，经过3 d的发酵，pH值迅速下降（P＜0.05），2.00%、1.75%和1.50%处理组的pH值均在5.50以下。pH值的降低对发酵肉制品很重要，不仅能够抑制腐败菌的生长[30]，而且对产品最终颜色和风味的形成也十分重要[2]。pH值在发酵3 d后趋于平稳，这可能与非蛋白氮以及氨基酸代谢的碱性产物积累有关[31]。除0 d外，处理组间的pH值随NaCl添加量的减少而降低，对照组的pH值显著高于其他处理组（P＜0.05），这可能是由于高含量的NaCl抑制了乳酸菌的生长[32]，而1.75%和1.50%处理组间差异不显著（P＞0.05）。由图2B可知，发酵初期乳酸菌总数在5.18～5.31（lg（CFU/g））之间，这些微生物主要来源于原料肉、调味料和加工环境等，随发酵时间的延长，各处理组中乳酸菌总数先迅速增加，在3 d达到最大，随后各处理组均呈降低趋势。这可能是由于发酵环境不利所致，如供乳酸菌生长的碳水化合物不足，以及可利用的水分逐渐减少[30]。与此同时，肠体水分损失造成高含量的NaCl也可能对乳酸菌生长具有一定的抑制作用。此外，NaCl添加量对乳酸菌的生长具有明显抑制作用，但在发酵末期不同处理组间差异不显著（P＞0.05）。

图2 NaCl添加量对风干肠发酵过程中pH值（A）和 乳酸菌总数（B）的影响Fig. 2 Effects of different NaCl levels on the pH (A) and lactic acid bacterial count (B) of air-dried sausages during fermentation

2.3 NaCl添加量对风干肠滋味特征的影响

电子舌是一种仿生味觉分析仪器，能基于人工味觉传感器阵列脂膜电势的变化，客观反映食品滋味的 变化[33]。由图3A可知，经12 d发酵风干肠的滋味变化显著（P＜0.05），其中酸味、涩味、苦味、鲜味、咸味增加，回味B（苦回味）和丰富度减少，回味A（涩回味）基本未变。这可能与发酵过程中水分减少，蛋白质、脂质和碳水化合物代谢以及微生物活动有关。0 d，随NaCl添加量的降低，除咸味外，鲜味和涩味也逐渐降低 （P＜0.05），这可能与滋味间的相互作用有关；12 d，随NaCl添加量的降低，酸味逐渐增加，这可能与乳酸菌代谢产生的有机酸有关。此外，咸味、鲜味和涩味随NaCl添加量的降低而呈下降趋势。这与Tian Xing等[34]的结论类似，研究发现在NaCl添加量为0%～5%的干腌猪肉中，咸味、鲜味和涩味随NaCl添加量的减少而减少。由图3B可知，主成分分析（principal component analysis，PCA）中，PC1和PC2的方差贡献率分别为76.4%和12.6%，累计方差贡献率为89%（＞85%），这表明前2个PC能反映有关样本总体特征的许多信息[20]。0 d样品分布在PC1负半轴，与丰富度和回味B相关，这表明0 d样品中这2种味道贡献较大，12 d样品与其他味道相关，说明发酵结束后的风干肠中滋味更加复杂丰富。此外，可以明显看出对照组（处于第1象限）与其他处理组（处于第4象限）的总体滋味相差较大，尤其是与1.50%处理组，而2.00%和1.75%处理组间的整体滋味最为接近。

图3 不同NaCl添加量的风干肠基于电子舌的滋味分析（A）和PCA（B）Fig. 3 Taste assessment (A) and PCA plot (B) based on electronic tongue data of air-dried sausages with different NaCl levels

2.4 NaCl添加量对风干肠气味特征的影响

电子鼻和电子舌的工作原理类似，是一种仿生嗅觉分析技术，可无损、快速和灵敏地实现对样品中挥发性气味信息进行全面评估[35]。由图4A可知，传感器W2W、W3S、W2S、W1W、W6S和W1S的响应值在0 d的样品中较大，尤其是W6S、W1S和W2S，这说明0 d样品中含有较多的含硫芳香有机物、长链烷烃和醇类等物质，其中W2S响应值较高可能与0 d风干肠中含有大量乙醇有关。传感器W1C、W3C和W5C的响应值在发酵12 d的样品中显著增加（P＜0.05），这说明发酵12 d后，风干肠中含有大量芳香成分（芳烃物质和芳香氮类组分等物质），这与GC-MS的结果一致。另外，W5S在1.50%处理组中的响应值最大，这表明该处理组中含有较多的氮氧化合物。由图4B可知，PC1和PC2的方差贡献率分别为85.3%和12.1%，累计方差贡献率为97.4%。0 d和12 d的处理组间的气味相差较大，分别分布在PC1的正负两轴。在发酵初期，处理组间整体气味较为相近，这与6种传感器（W2W、W3S、W2S、W1W、W6S和W1S）对应的挥发性气味物质相关，而在发酵末期，处理组间差异较大，这与W5S、W1C、W3C和W5C传感器对应的挥发性气味物质相关，其中NaCl添加量为2.00%和1.75%的处理组相互靠近，这说明这2个处理组的整体气味相近。

图4 不同NaCl添加量的风干肠基于电子鼻的气味分析（A）和PCA（B）Fig. 4 Odor radar plot (A) and PCA plot (B) based on electronic nose data of air-dried sausages with different NaCl levels

2.5 NaCl添加量对风干肠挥发性物质的影响

由表1可知，在风干肠中共检出48种挥发性物质，包括醛类、酮类、醇类、酸类、酯类和萜烯类，这些化合物主要源于脂质氧化、蛋白质和碳水化合物分解代谢、细菌酯化反应、白酒和香辛料[36-37]。在风干肠中共检测到4种醛类，己醛、壬醛和辛醛为常见的挥发性醛类物质，主要源于不饱和脂肪酸的自动氧化，由于其阈值较低且有明显的脂肪香味，对发酵肉制品的风味形成具有重要贡献[26]。随着发酵的进行，这些化合物含量显著增加（P＜0.05），在发酵末期，壬醛的含量最大，但不同处理组间多数醛类（除壬醛外）含量差异不显著（P＞0.05）。通常而言，多数醇和酮类化合物源自碳水化合物代谢、脂质β-氧化和氨基酸分解代谢[32]，酮类相比其同分异构体的醛类阈值要高，而醇类（除不饱和醇外）的阈值也较高，因此它们对风干肠的整体风味贡献相对较小[26]。酮类物质中甲基酮（2-壬酮）源于微生物对不饱和脂肪酸的β-氧化，是发酵香肠的特征发酵风味物质[38]，其在不同处理组间差异不显著（P＞0.05）。对于醇类而言，由于风干肠在制作时添加了1%的白酒，因此乙醇在0 d时含量最大。但发酵12 d后其含量显著降低（P＜0.05），这可能是发酵过程中乙醇参与了乙酯类化合物的形成。同时，在发酵末期，乙醇含量随NaCl添加量的降低而显著增加（P＜0.05），这可能与风干肠中乳酸菌的数量有关，发酵过程中，乙醇主要源于乳酸菌对碳水化合物的发酵作用[32]。此外，2,3-丁二醇是由碳水化合物代谢形成的，具有典型奶油气味[39]，经发酵后产生，其含量随着NaCl添加量的降低而呈现降低趋势 （P＜0.05）；而2-庚醇和辛醇呈相反的趋势，其可在乳酸菌作用下由某些氨基酸转化形成[40]，另外，苯乙醇呈玫瑰味，由微生物代谢苯丙氨酸产生[41]，但在不同处理组间未呈明显的变化趋势。酸类物质在0 d时仅有己酸被检测出，但随着发酵的进行有大量酸类物质产生。其中乙酸和丁酸主要源于乳酸菌对糖类物质的代谢，因此在低盐处理组中有大量的检出，这些物质气味阈值低，对发酵风味影响较大。其他酸类物质（如己酸、辛酸和壬酸）则由脂质氧化产生[4,42]，其中除壬酸和癸酸外，处理组间差异不显著（P＜0.05）。酯类共检出6种，多数都具有果香或酒香，对风干肠的最终风味贡献很大，其主要来源于醇类与酸类间的酯化反应、在转移酶作用下由乙酰辅酶A和高级醇为底物形成以及原材料的大曲酒[37]。相比于0 d，12 d的处理组中酯类种类和含量显著增加（P＜0.05），且多数（除乙酸乙酯和癸酸乙酯）在较高NaCl添加量的处理组中含量较高，这可能与较高NaCl含量风干肠中细菌酯化活性更强有关[32]。此外，风干肠中检测到大量源于香辛料的风味物质（如反式肉桂醛、小茴香酮、香叶醇以及萜烯化合物），这些风味物质在发酵过程中随着风干的进行，含量显著增加（P＜0.05），且整体而言在高盐处理组中含量较高，这可能与其中的水分含量有关。

表1 不同NaCl添加量的风干肠在发酵过程中挥发性化合物含量的变化Table 1 Changes in volatile compound contents of air-dried sausages with different NaCl levels during fermentation μg/kg

续表1 μg/kg

2.6 NaCl添加量对风干肠感官评价的影响

如图5所示，NaCl可通过影响水分含量以及蛋白质和脂质氧化间接影响产品的颜色，但不同NaCl添加量风干肠的色泽差异不显著（P＞0.05），这可能与熟制风干肠中肌红蛋白受热变性呈灰褐色有关[43]。另外，口感和气味在处理组间差异亦不显著（P＞0.05）。对于咸味和酸味而言，降低NaCl添加量显著降低了风干肠的咸味，提升了酸味（P＜0.05），这与电子舌的结果一致。在NaCl添加量为2.00%时，风干肠咸度适中，具备风干肠“咸香”的特征。就总体可接受性而言，NaCl添加量为1.75%和2.00%的风干肠得分最高（P＞0.05），但NaCl添加量为1.75%的风干肠咸度稍有不足。

图5 不同NaCl添加量风干肠的感官评定Fig. 5 Sensory evaluation of air-dried sausages with different NaCl levels

3 结 论

本研究基于智能感官和GC-MS联用技术分析不同NaCl添加量对风干肠风味特征的影响。结果表明，减少NaCl添加量增加了风干肠的水分含量、aw和乳酸菌总数，降低了pH值。电子鼻和电子舌结果表明，NaCl添加量为2.00%和1.75%的风干肠整体气味和滋味最为相近。此外，降低NaCl添加量会促进源于碳水化合物代谢的挥发性化合物的形成，而降低源于酯化反应的挥发性化合物的形成。感官评价结果表明，NaCl添加量为2.00%和1.75%的风干肠总体可接受性最高，但后者风干肠“咸香”特征稍有不足。基于本研究可以将风干肠中NaCl添加量降低20%～30%，在后续研究中仍需考虑低盐风干肠的微生物特性及安全性，同时协同“增咸”技术提高NaCl添加量为1.75%风干肠的咸味，为低盐风干肠的研发提供基础。