超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱鉴定核桃仁的脂质构成

支虎明，王星苏，赵佳佳，乔 玲，武棒棒，郑兴卫，闫素仙,*，郑 军,*

（1.山西农业大学小麦研究所，山西 临汾 041000；2.山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041000）

核桃（Juglans regiaL.）属于胡桃科胡桃属，含油量约为52%～70%，是我国重要的经济树种。我国种植核桃已有2000多年的历史，是核桃属植物的发源地。2019年我国核桃总产量达158.6万 t，占世界总产量的43.31%[1]。由于核桃仁含有丰富的营养可直接鲜食或干制食用，还能加工成核桃粉、核桃乳、核桃酥糖和椒盐核桃等食品。核桃仁还是食用油的良好来源，不仅可用于烹饪，而且因亚麻酸含量高和干燥快，还可用作油漆和充当化妆品成分[2]。核桃仁中的油脂含有大量亚油酸（C18:2）和亚麻酸（C18:3）等人体必需的不饱和脂肪酸，这些脂肪酸能降低人血清中胆固醇和甘油三酯（triacylglycerol，TG）的含量，有效防止动脉硬化、冠心病、胆固醇和糖尿病等疾病的发生[3]；核桃仁中n-3与n-6不饱和脂肪酸的比例有利于人类健康，是理想的保健食品[4]。此外，核桃仁中的磷脂能延缓大脑细胞衰老，抑制肿瘤生长[5]。因此大力开发核桃仁的功能产品和保健作用，可以改善人们的膳食营养和健康水平。

关于核桃仁脂质成分研究较少，脂质组分不明确已成为核桃优良品种选育和功能食品开发的主要限制因素。冯春燕[6]、余启明[7]等利用气相色谱对云南、陕西和北京等不同地区核桃仁的脂肪酸进行比较，发现脂肪酸组成基本一致，但品种间脂肪酸含量差异明显。山西不同地区10种核桃油的脂肪酸和生育酚组成差异也较大，且油酸含量的变异系数最大[8]。在开心果、腰果、花生、山核桃、杏仁和核桃6种坚果的磷脂成分中，核桃占据了96种，含量和种类都多于其他坚果[9]。进一步针对核桃油、香油、荸荠油、榛子油和山毛榉油的TG进行检测，发现核桃油以TG(54:6-8)为主[10]。目前有关核桃的脂质成分研究，多采用色谱法或联合其他分离方法鉴定脂肪酸、磷脂和甘油酯等单一脂质的组成和含量，对核桃全脂质组成的系统研究鲜见报道。

由于脂质化学成分的多样性和复杂性，国际脂质分类和命名委员会提出了较为权威的分类方法，将脂质分为脂肪酸类（fatty acid，FA）、甘油脂、磷脂类、鞘脂类、糖脂类、固醇脂类、孕烯醇酮脂类和多聚乙烯类共8 大类[11]。脂质组学是基于高通量分析技术，系统解析生物体内脂质组成与表达的研究方法，可高效分析鉴定脂质家族及其代谢物[12]。脂质组学可以全面鉴定食品中8 大类脂质的含量，进而了解相关成分在代谢调控中的作用，为现代食品科技发展提供一个崭新的视角。超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatography coupled to orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Orbitrap HRMS）可以将脂质分子高效分离后准确定性，是目前脂质组中检测最高效的方法，具有灵敏度高和分辨率好的优点。卫海莲等[13]利用UPLC-TOF-MS/MS快速准确地分析出青刺果油的脂质组成、种类及相对含量。将UPLC-HRMS应用于花生、大豆等5种油料作物脂质成分的比较研究，共鉴定出132种脂质分子[14]。基于UPLC结合Orbitrap质谱仪的分析平台，Karen等[15]分析了6种微藻的脂质组，得到了102种TG。Lu Shaoping等[16]在油菜不同组织中，共检测出13种脂质亚类，218种甘油酯，甚至检测到很多低丰度的脂质分子。此外，白菜叶片中成功鉴定出232种脂质，包含104种磷脂、63种糖脂和65种甘油酯[17]。可见UPLC-Orbitrap HRMS的应用日趋成熟，为植物脂质代谢研究提供了可靠的分析平台。核桃是我国最主要的油料坚果，核桃仁脂质组分是影响其生长发育、口味、营养品质和功能的重要因素，关于核桃仁脂质组全面分析的研究鲜见报道。本实验采用UPLC-Orbitrap HRMS对核桃仁脂质组成进行定性和定量分析，以期为研究核桃功能性脂质成分，提升核桃营养品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清香核桃，1983年由河北农业大学从日本引进，因其适应性强、果大仁满，在山西、新疆、河北、山东和湖北等省份大面积种植，是我国种植面积最大的 品种[18-19]。核桃样品采集于山西农业大学小麦研究所隰县试验站（东经110°57′，北纬36°42′，海拔1 100 m，年平均降水量570 mm，年平均气温9.5 ℃），在产量稳定的果园中选取正常发育的植株；10月中旬收获后，去青皮，清洗后于32 ℃烘10 h，37 ℃烘24 h去除70%水分，35 ℃烘15 h后备用。

乙腈、异丙醇、甲醇、甲基叔丁基醚（均为分析纯） 美国Thermo Fisher公司；SPLASH LIPIDOMIX同位素内标：1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸、 1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺、1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰甘油、1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰肌醇、1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酸、1-油酰基-2-羟基磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-羟基磷脂酰肌醇、1-十五烷酰基-2-油酰基甘油二酯、1,3-二十五烷酰基-2-油酰基甘油三酯、胆固醇酯、N-油酰基-D-赤型-鞘脂类磷脂酰胆碱、N-十六烷酰基二氢鞘氨醇 美国Avanti公司。

1.2 仪器与设备

Nexera LC-30A UPLC仪 日本岛津有限公司；Q-Exactive质谱仪 美国Thermo Scientific公司；5430R高速冷冻离心机 美国Eppendorf公司；Acquity UPLC CSH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美国Water公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

选出来自不同果树的光滑饱满，大小一致的果仁10 份。将样品用液氮磨成粉状，将10 份材料混匀，每次上样取30 mg加入200 μL水和20 μL内标溶液，混匀后加入800 μL甲基叔丁基醚，涡旋混合，最后加240 μL预冷甲醇涡旋混合。低温水浴中超声20 min，室温放置30 min，10 ℃、14 000×g离心15 min取上层有机相，氮气吹干；加入200 μL 90%异丙醇-乙腈溶液复溶，充分涡旋，取90 μL复溶液，10 ℃、14 000×g离心15 min，取3 μL上清液进样分析。连续检测5 次。

1.3.2 色谱条件

采用超高效液相色谱系统进行分离，C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；柱温45 ℃；流速300 μL/min。流动相A：乙腈溶液（乙腈-水，6∶4，V/V）；流动相B：乙腈-异丙醇溶液（乙腈-异丙醇，1∶9，V/V）。梯度洗脱步骤：0～2 min，70% A，30% B；2～25 min， 70%～0% A，30%～100% B；25～35 min，70% A，30% B。整个分析过程中样品置于10 ℃自动进样器中。

1.3.3 质谱条件

样品经UPLC分离后用Q Exactive质谱仪进行质谱分析，电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子和负离子模式进行检测。ESI条件如下：鞘气流速45 arb；辅助气流速15 arb；碰撞气流速1 arb；喷雾电压3.0 kV；毛细管温度350 ℃；雾化温度300 ℃；透镜电压水平为50%；MS1扫描范围m/z200～1 800。脂质分子和脂质碎片的质荷比通过每次全扫描后采集10个碎片图谱（MS2scan）得到；MS1在m/z200时分辨率为70 000，MS2在m/z200时分辨率为17 500。

1.4 数据处理

采用同位素内标法，利用待测物与内标的响应丰度比值（峰面积比）以及内标的浓度，计算待测物的绝对含量。利用AnalystR TF 1.6和Multi QuantTM软件获得数据，采用Lipid Search对脂质分子及内标脂质分子进行峰识别、峰提取和脂质鉴定等处理，形成内部数据。主要参数：前体容许偏差5×10-6，产物容许偏差5×10-6，产物离子阈值5%。对脂类分子种类进行鉴定，主要根据保留时间、m/z和碎片离子模式；提取得到的数据，进行数量统计和脂质组成分析。采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.5绘制图表。

2 结果与分析

2.1 色谱保留行为

同一种类脂质分子的洗脱顺序由脂肪酸链碳原子数和双键数决定。一般情况下，碳原子数多则保留时间长，洗脱较慢；双键数越多则保留时间短，洗脱快。在25 min左右样品峰基本检测完成，脂质分子峰形较好、分离度和响应值好。5 次上样的色谱图进行比较，样本的色谱峰响应强度和保留时间基本重叠（图1），说明实验重复性和稳定性较好。

图1 在正离子（a）、负离子（b）模式下色谱图Fig. 1 Chromatograms in ESI positive (a) and negative ion modes (b)

2.2 脂质鉴定结果

脂质分子碰撞诱导解离导致不同结构位点的化学键断裂，产生特异性离子或中性丢失碎片离子。在正、负离子模式下，分别对样品进行扫描，确定准分子离子，优化毛细管电压等参数，使特征碎片离子峰强度最大，选择丰度较高的2个分子离子作为定性离子，丰度最高的作为定量离子。在正离子模式下，TG、甘油二酯（diacylglycerol，DG），部分磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和溶血性磷脂酰胆碱（lyso-posphatidyl choline，LPC）质谱响应强度较好（图2a）。TG、DG电离形成[M+NH4]+，PC、PE和LPC产生[M+H]+。在负离子模式下，磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol，PI）、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol diphosphate，PIP）、双磷脂酰甘油（cardiolipin，CL）、溶血性磷脂酰乙醇胺（lysoposphatidyl ethanolamine，LPE）、溶血性磷脂酰甘油（lyso-phosphatidylglycerol，LPG）、溶血性磷脂酰肌醇（lyso-phosphatidyl inositol，LPI），部分PE、PC和糖脂质谱有较好的响应（图2b）。PI、PA、PS、PG、PIP、PE、CL、LPE、LPG、LPI电离形成[M+H]-，PC和糖脂产生[M+HCOO]-。

图2 在正离子（a）和负离子（b）模式下色谱图Fig. 2 Chromatograms in ESI positive (a) and negative ion modes (b)

参考Lipid Maps（https://www.lipidmaps.org/）和Lipid Bank（http://www. lipidbank.jp/）脂质数据库，结合脂质分子在正、负离子模式下色谱图的保留时间、一级质谱图和二级质谱图的数据，可鉴别核桃仁中的脂质分子，以TG(54:7)、PC(34:2)和PA(35:2)为例解析质谱行为。

TG(54:7)在正离子模式下其主要的质谱峰为[M+NH4]+（m/z894.754 5）。TG的二级质谱，产生碎片离子m/z597.488 1、597.503 8和337.274 6，对应[FA(18:2)-H+NH4]+、NL[FA(18:3)-H+NH4]+和MG(18:2)-OH，经解离产生特征碎片离子m/z263.236 8和m/z261.221 2（图3a），对应脂肪酸C18:2和C18:3，可鉴定为TG(18:2/18:2/18:3)。

PC(34:2)在负离子模式下产生[M-H]-（m/z802.560 360 5），二级质谱图主要产生m/z742.537 77、279.233 5和255.233 5的碎片离子，依次对应于[M-CH3]-PC头部甲基丢失、断裂的脂肪酸C18:2和C16:0（图3b），分子结构鉴定为PC(16:0/18:2)。

PA(35:2)在负离子模式下产生母离子[M-H]-（m/z685.481 381 5），二级质谱产生m/z405.242的离子碎片，鉴定为[LPA(17:0)-H2O-H]-，经碰撞诱导解离，产生碎片离子m/z279.233 5和m/z269.249 1，对应脂肪酸C18:2和C17:0（图3c），鉴定为PA(17:0/18:2)。

2.3 核桃仁中脂质种类

核桃仁中鉴定到脂质亚类共20种，脂质分子525种。不同亚类的脂质分子数量差异很大（图4），共检测到甘油脂有250种，其中TG的数量最多，共有207种，DG有43种；221种磷脂包括50种PC、31种PA、36种PE、35种PS、19种PI、14种PG、12种LPC、5种LPE、2种LPG、2种LPI、5种PIP和10种CL；鞘脂类共36种，包括28种神经酰胺（ceramides，Cer），7种CerG1，1种鞘磷脂（sphingomyelin，SM）；18种糖脂，包括3种单半乳糖甘油二酯（monogalactosyldiacylglycerol，MGDG），9种双半乳糖甘油二酯（digalactosyl-diacylglycerol，DGDG），6种硫代异鼠李糖甘油二酯（sulfoquinovosyl-diacylglycerol，SQDG）。

此外，在核桃仁中脂肪酸的种类丰富，包括21种饱和脂肪酸，分别为C4:0、C8:0、C10:0、C12:0、C13:0、C15:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C19:0、C20:0、C21:0、C22:0、C23:0、C24:0、C25:0、C26:0、C27:0、C29:0、C30:0；27种不饱和脂肪酸：C10:1、C10:2、C12:1、C14:1、C14:2、C14:3、C16:1、C17:1、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C19:1、C20:1、C21:1、C20:2、C20:4、C20:5、C22:4、C22:5、C22:6、C24:1、C24:2、C26:1、C28:1、C29:1、C30:1。检测出较低含量的稀有中链脂肪酸C4:0、C8:0、C10:0、C10:1、C10:2和超长链脂肪酸C24:2、C25:0、C26:0、C27:0、C26:1、C28:1、C29:1、C30:1。核桃仁中长链不饱和脂肪酸的存在意味着特殊脂肪脱氢酶或延长酶的存在，负责甘油酯链的不饱和及延长[20]。

郑殊宁等[17]在大白菜中鉴定出14种脂质亚类，共232种脂质分子；Song Shuang等[9]在核桃中鉴定出10种磷脂亚类，共96种磷脂分子；在青刺果油中鉴定出14个脂质亚类，169种脂质分子[13]。本实验利用UPLCOrbitrap HRMS在核桃中测出20种亚类共计525种脂质分子，其中磷脂亚类12种，磷脂分子221种，还测出了135个痕量脂质分子，数量远高于之前的报道。

2.4 脂质各亚类含量

核桃仁中脂质含量为145 523.45 μg/g，甘油脂含量最高，以DG和TG为主，分别占总脂质的45.23%和41.77%；磷脂的种类最多，包括PA、PG、PS、PC、PE、LPC、PI、LPG、LPI、LPE、PIP和CL共12种，占总脂质的12.97%；糖脂占到0.02%，含量较少；鞘脂类只有0.01%。

2.4.1 核桃仁中甘油脂组成

核桃仁中共鉴定出207种TG，含量最高的是TG(18:2/18:2/18:3)（二亚油酸亚麻酸甘油三酯，LLLn），约占总脂质的15.65%；其次是TG(18:1/18:1/18:1)（三油酸甘油三酯，OOO）、TG(18:2/18:3/18:3)（二亚麻酸亚油酸甘油三酯，LnLnL）、TG(18:1/18:2/18:3)（亚麻酸亚油酸油酸甘油三酯，OLLn），分别占4.50%、4.33%和3.05%。核桃仁中TG(54:3-7)最多，主要由亚油酸、亚麻酸和油酸组成，占总脂质的27.53%（表1）。43种DG中含量最高的是DG(18:2/18:2)，其次是DG(18:1/18:2)、DG(16:0/18:2)、DG(18:2/18:3)、DG(18:1/18:1)，分别占19.69%、7.36%、7.52%、4.30%和3.65%。

表1 核桃仁中含量较高的30种TG分子Table 1 Analysis of 30 major TGs in walnut kernel

植物油脂合成路径中甘油-3-磷酸以脂酰辅酶A为供体，在甘油三磷酸酰基转移酶催化下生成LPA；LPA在LPA酰基转移酶催化下形成PA，PA去磷酸化产生DG。种子油脂积累过程中DG在DAG酰基转移酶酰基化形成TG，TG与油体蛋白形成油脂[21]。分析TG和DG分子结构，发现TG均含有类似的DG碳骨架分子，且主要以18:2/18:2、18:1/18:2、18:2/16:0、18:2/18:3、18:1/18:1为主，可能是从头合成的脂肪酸主要是棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1），油酸（C18:1）去饱和形成亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）[22]。 TG(18:2/18:2/18:3)由DG(18:2/18:2)酰基化形成，但核桃仁中TG(18:2/18:2/18:3)相对含量为15.64%，DG(18:2/18:2)的相对含量较高为19.69%，可见调节DG形成TG的代谢途径，是进一步提高油脂产量的有效方法。

已有研究表明TG在植物油脂中含量最高，在不同的坚果油中富含的TG分子不同。香油主要以TG(54:3-6) 为主，荸荠油以TG(54:2-3)为主，榛子油TG(54:3)与TG(52:2)含量高而山毛榉油以TG(54:5)居多，核桃油的TG(54:6-8)最多，占总脂质的38.9%，是其他坚果油的2 倍[10]。本实验检测到核桃仁中以TG(54:6-8)最多，占总脂质的23.03%，核桃中TG的不饱和程度远高于其他坚果，直接影响核桃的品质和营养价值。

核桃仁大部分TG分子含有的碳原子数集中在50～56之间，属于中链。中链脂肪酸甘油三酯容易被人体分解吸收[23]，这可能是核桃仁脂质组成有利于人体健康的原因之一。核桃仁TG中双键数为7的分子最多，说明TG中含有大量的不饱和脂肪酸（图4）。有研究证明，用核桃取代饮食中的不饱和脂肪酸，可有效降低高血脂患者胆固醇水平和低密度脂蛋白，核桃中不饱和脂肪酸可促进低密度脂蛋白的氧化，氧化的低密度脂蛋白在动脉粥样硬化中可发挥重要作用[24]。核桃TG中的不饱和脂肪酸以亚油酸（C18:2）含量最高，其次为亚麻酸、油酸。亚油酸氧化会产生正丁醛、2-丁烯醛、戊烯醛以及己烯醛等挥发性成分，已有研究表明这类物质决定核桃仁的风味和口感[25]。亚麻酸在人体中会转化成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸是神经组织膜磷脂的重要组成，在神经保护、脑动脉血管扩张和神经可塑性等方面起重要 作用[26]。因此，长期适当补充核桃仁能改善老年人的认知障碍，提高学习记忆能力。

图4 TG分子的链长度（a）和链不饱和度（b）Fig. 4 Chain length (a) and unsaturation (b) of TGs

2.4.2 核桃仁中磷脂组成

核桃仁中含有较丰富的磷脂，约占总脂质的12.97%，包括PA、PG、PS、PC、PE、LPC、PI、LPE、CL、PIP、LPI和LPG。其中PA、PG、PS、PC和PE分别占磷脂的43.88%、22.85%、11.32%、10.64%和6.16%，其他为5.15%（图5）。含量较多的磷脂分子：PA(17:0/18:2)、PA(17:0/18:1)、PA(18:2/18:2)、PA(19:1/18:1)和PG(44:0)（表2）。DG(18:2/18:2)含量约占19.69%，而目前检测到的PA(18:2/18:2)仅有0.59%，说明PA作为前体转化生成了DG。PA、PG、PI、PE、PC这5种磷脂均含有相同的DG碳骨架分子16:0/18:1、16:0/18:2和16:0/18:3，已证明PC和PG分子可作为sn-2位C18脂肪酸去饱和的载体[27]。Song Shuang等[9]比较6种坚果的磷脂成分，测得核桃磷脂含量依次为PI、PE、PC、PA、PG、LPC、PS和LPE，没有SM，与实验结果不同，可能是由于Song Shuang等[9]的测试样品来源不清造成的差异。

表2 核桃仁中含量较高（≥0.1%）的19种磷脂分子Table 2 Analysis of 19 phospholipids with higher contents (≥0.1%) in walnut kernel

本实验检测到核桃仁中磷脂种类较为丰富。PA可作为磷脂、糖脂和甘油酯形成的共同底物，还可作为信号分子，参与细胞生长和分化、信号接收和转导等过程，在代谢调节过程中具有重要作用[28]。PC是组成细胞膜脂蛋白的重要成分，也是胆碱合成的重要前体，胆碱通过血液循环进入大脑，可与乙酰辅酶A合成乙酰胆碱，促进大脑的神经细胞兴奋[29]。PI不仅是膜脂成分，也是与信号转导和细胞周期相关的多磷酸肌醇磷脂的前体。PS中含有氨基，协同VE发挥抗氧化作用。PE、PG在膜脂中含量丰富，具有抗氧化作用的生物活性脂类[30]。LPC、LPE等溶血磷脂不仅可作为生物膜磷脂的代谢物，还是细胞内的信号分子，参与调控细胞增殖、肿瘤细胞侵染和创伤愈合等广泛的细胞活动[31]。因此，建议多食用核桃及核桃制品以补充人体磷脂摄入量。

2.4.3 核桃仁中糖脂组成

核桃仁中糖脂含量相对较低，仅占总脂质的0.02%。如图5所示，DGDG是主要成分，含量为26.8 μg/g。DGDG中含量较多的是DGDG(18:2/18:2)、DGDG(18:2/18:3)和DGDG(16:0/18:2)。MGDG含量为6.2 μg/g，SQDG为1.6 μg/g。糖脂是核桃仁中构成膜脂的主要成分，含量较少。甘油糖脂还具有多种药理学功能，如抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等[32]。

图5 磷脂（a）和糖脂（b）各亚类含量Fig. 5 Contents of GP (a) and SL (b) subclasses

2.4.4 核桃仁中鞘脂类组成

核桃仁中Cer和SM仅占到总脂质的0.01%。Cer含量为10.5 μg/g，共鉴定出35种分子，Cer(d32:0)和Cer(d34:0)的含量较多。这类物质作为细胞的第二信号分子，可以促进细胞的增殖，凋亡和生长停滞，还可以抑制肿瘤的发生和转移并增加肿瘤对化疗药物的敏感性[33]。此外，首次检测到核桃仁脂质中存在1种SM(d22:1)，这类物质在其他油料作物中尚未有报道。

3 结 论

采用UPLC-Orbitrap HRMS技术系统分析了核桃仁的脂质组成，共鉴定出525种脂质分子，包含250种甘油酯、221种磷脂、18种糖脂和36种鞘脂类。甘油酯包括DG（45.23%）和TG（41.77%）。TG分子中TG(18:2/18:2/18:3)含量最高，DG分子中DG(18:2/18:2)含量最高。DG和TG中的脂肪酸链主要由亚油酸、亚麻酸等人体必需脂肪酸组成。磷脂占总脂质的12.97%，种类较为丰富，其中PA含量最高，约为总磷脂的43.88%。本实验构建的核桃脂质图谱对核桃脂质代谢和功能开发的研究具有重要理论和应用价值。