酶促酯化制备DAG过程中的酰基转移研究

宋志华，鲁 珊，黄健花，金青哲，王兴国

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

甘二酯，又称甘油二酯、脂肪酸甘油二酯(DAG)，按空间异构分为1,3-甘二酯(1,3-DAG)和1,2-甘二酯(1,2-DAG)两类，两类DAG的功能差异较大，前者可抑制脂肪积累、预防肥胖及肥胖引发的相关疾病[1]，后者具有细胞信号分子、促进伤口愈合、改善糖尿病大鼠心肌功能紊乱[2-3]等作用。

酶促催化制备DAG工艺途径主要包括酯交换法和直接酯化法。充分利用不同酶促催化位点的不同，制取获得特定构型或特定脂肪酸DAG已成为当前研究的热点。祝雨筱等[3]利用Lipozyme 435催化酯交换合成1,2-DAG，刘四磊等[4]利用Lipozyme RM IM催化酯化制取富含花生四烯酸的1,3-DAG。然而，不管是酯交换法还是直接酯化法，都会伴随酰基转移产生一些副产物，如单甘酯(MAG)、甘三酯(TAG)；同时，现有关于酶促催化制备DAG的研究，主要集中于酶筛选、催化参数优化方面[3-5]。有关酰基转移的研究报道也主要针对酶促催化的酯交换反应体系，如：Laszlo等[6]研究酶促催化高油酸葵花籽油-乙醇酯交换体系酰基迁移动力学；李人望[7]研究了酶促催化单甘酯-甲醇酯交换体系中溶剂对脂肪酶位置选择性和酰基转移的影响；Pacheco等[8]研究了酶促催化大豆油-完全氢化大豆油酯交换体系的酰基转移情况。鲜有关于酶促催化酯化反应体系酰基转移规律的研究和报道。因此，研究探讨酶促催化酯化制备DAG反应体系下的酰基转移规律，对于丰富和完善酶促催化基础理论体系，指导DAG合成、获得特定高纯DAG产物具有重要意义。本文采用Sn-1,3特异性脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂，以油酸和甘油的酶促酯化反应体系为模型，初步探讨酶促酯化制备DAG过程中的酰基转移规律，以期为酶促催化酯化制备DAG过程中的酰基转移调控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Lipozyme RM IM，诺维信生物技术有限公司；甘油、油酸、乙酸均为分析纯，国药化学试剂有限公司；异丙醇、正己烷均为色谱纯，北京百灵威科技有限公司。

Re-501型旋转蒸发器，Waters1525高效液相色谱仪，Alltech3300蒸发光散射检测器， Waters Spherisorb Silica 色谱柱(2.0 mm×250 mm，5 μm)，AR2140精密电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 酯化合成DAG

按一定摩尔比称取适量的油酸与甘油置于50 mL圆底烧瓶，添加一定量脂肪酶，在一定温度的水浴下真空旋转反应(80 r/min，0.1 MPa)，反应过程中按一定时间间隔取样， 分析产物的甘油酯组成。所有试验因素水平均同时进行3次重复试验。

1.2.2 酯化产物甘油酯组成分析

取酯化产物0.5 mL，加入0.5 mL高纯水和5 mL正己烷，旋涡振荡萃取1 min，离心收集有机相，氮吹挥干溶剂后定容至10 mL进行HPLC分析。

检测条件[9]：Spherisorb Silica 色谱柱(2.0 mm×250 mm，5 μm)；柱温35℃；流动相A为正己烷-异丙醇(体积比99∶1)，流动相B为正己烷-异丙醇-乙酸(体积比1∶1∶0.01)；采用梯度洗脱，0～10 min A由100%降至80%，10～14 min A由80%降至70%，14～15 min A由70%升至100%并保持5 min；流动相流速0.5 mL/min；进样量10 μL；蒸发光散射检测器漂移管温度75℃。采用面积归一化法进行定量。

1.2.3 酯化反应酰基转移表征

Lipozyme RM IM为1,3-特异性脂肪酶，故反应体系的酰基转移产物主要为1,2-DAG、2-MAG和TAG，检测酰基转移产物组成发现2-MAG未检出，故本文采用酰基转移产物中1,2-DAG在DAG的占比直观反映体系中DAG的酰基转移情况，同时，对体系的DAG含量变化情况进行监测。1,2-DAG在DAG的占比以酰基转移率表示，计算公式如下。

酰基转移率=1,2-DAG含量/(1,2-DAG含量+1,3-DAG含量)×100%

2 结果与讨论

2.1 酯化时间对酰基转移的影响

在底物(油酸与甘油)摩尔比2∶1、酯化温度65℃、Lipozyme RM IM添加量6%(以底物总质量计，下同)的条件下，探讨酯化时间对酶促酯化合成DAG过程中酰基转移的影响，结果如图1所示。

图1 酯化时间对酶促酯化合成DAG过程中 酰基转移的影响

由图1可知，酰基转移率随酯化时间的延长不断增加，10 h时的酰基转移率达26.1%。同时发现，随着酯化时间的延长，体系中DAG的含量先增加后下降，在2 h时DAG含量最高，之后随酯化时间延长DAG含量下降。这是由于随着反应进行DAG进一步反应生成TAG，而Lipozyme RM IM催化生成TAG过程中，1,2-DAG较1,3-DAG更易发生反应，故随着反应的进行，1,3-DAG不断发生酰基转移形成1,2-DAG，导致酰基转移率随之不断增加[10]。因此，反应时间控制在1 h以内可以尽可能减少酰基转移发生，保证体系产物具有较高的1,3-DAG含量。

2.2 底物摩尔比对酰基转移的影响

根据甘油与脂肪酸酯化反应的理论方程，综合考虑反应效率和成本，酶促酯化制备DAG过程中，脂肪酸与甘油的理论最佳摩尔比为2∶1。改变底物组成会影响体系的扩散传质，进而影响反应，脂肪酸含量过高，利于反应过程中1,3-DAG酰基转移形成1,2-DAG和生成TAG；甘油含量增加则体系黏度加大、极性增强，不利于其与脂肪酸的有效接触，进而影响反应速率[11]。在酯化温度65℃、酯化时间2 h、Lipozyme RM IM 添加量6%的条件下，探讨底物(油酸与甘油)摩尔比对酶促酯化合成DAG过程中酰基转移的影响，结果如图2所示。

图2 底物摩尔比对酶促酯化合成DAG过程中 酰基转移的影响

由图2可知，底物摩尔比对反应体系的酰基转移影响不大，不同底物摩尔比反应时的酰基转移率变化不大，基本在11%左右，在底物摩尔比为2∶1时酰基转移率相对略低，符合理论最佳值。不同底物摩尔比反应产物的DAG含量也无明显差异。这可能是由于脂肪酶具有活性位点，其通常被α-螺旋“盖子”遮盖，只有当吸附于油-水界面时才会在油相疏水作用下，打开“盖子”，暴露活性位点，发生催化作用[12]。而本实验条件下底物摩尔比的改变对酶在油水界面发挥催化作用的影响不大。底物摩尔比过小，甘油反应不充分，DAG含量略低；底物摩尔比过大，脂肪酸过量导致TAG含量增加、DAG含量下降。综合评估，当底物摩尔比控制在2∶1时，体系的酰基转移率最低，产物中1,3-DAG含量最高。

2.3 酶添加量对酰基转移的影响

在底物(油酸与甘油)摩尔比2∶1、酯化温度65℃、酯化时间2 h的条件下，探讨酶添加量对酶促酯化合成DAG过程中酰基转移的影响，结果如图3所示。

图3 酶添加量对酶促酯化合成DAG过程中 酰基转移的影响

由图3可知，当酶添加量分别为2%、4%和6%时，对应的酰基转移率分别为9.8%、10.6%和10.5%，酰基转移率变化不大，相应的DAG含量则从48%上升到68%。这是由于一开始酶添加量较低时，酶在油-水反应界面的浓度随酶添加量的增加而逐渐增大，从而有效提高了反应速率[13]，导致DAG含量的增加。当进一步增大酶用量时，酰基转移率与DAG含量的变化趋势相反，即DAG含量呈现降低趋势，酰基转移率则明显增加，酰基转移率由10.5%(酶添加量6%)增加至15.2%(酶添加量10%)。说明当酶添加量达到6%时，酶基本在油-水反应界面达到饱和，此时进一步增加酶用量，导致副反应增加[14]，形成更多的副产物TAG，进而推动1,3-DAG的酰基转移，导致酰基转移率的增加。因此，在现有反应条件下，6%的酶添加量可以保证产物具有较高的1,3-DAG含量。

2.4 酯化温度对酰基转移的影响

通常酶具有最适温度，在最适温度下表现出理想的催化活性。在底物(油酸与甘油)摩尔比2∶1、酯化时间2 h、Lipozyme RM IM 添加量6%的条件下，探讨酯化温度对酶促酯化合成DAG过程中酰基转移的影响，结果如图4所示。

图4 酯化温度对酶促酯化合成DAG过程中 酰基转移的影响

升高酯化温度，利于降低体系黏度，提高底物间相容性，加快传质，提升反应速率；同时，本研究所采用的反应装置带有真空脱水功能，在一定范围内升高酯化温度，有利于反应产物水的脱除，促进反应向正反应方向进行；然而，当酯化温度过高时，会影响酶的空间结构和构象，降低酶的活性。由图4可知，酯化温度升高明显促进酰基转移，45℃时的酰基转移率仅为6.4%，而75℃时的酰基转移率达15.1%。即使在75℃酶活降低的情况下，酰基转移率仍较65℃反应体系明显增加，这是由于随着酯化温度的进一步升高(高于65℃)，热力学平衡占据主导地位，酰基转移急剧增加所致[15]。因此，酯化温度应控制在65℃为宜。

3 结 论

Sn-1,3特异性脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化油酸和甘油合成DAG的过程中，体系的酰基转移情况呈现如下规律：酯化温度和酯化时间与体系酰基转移率呈现正相关性，酯化温度的升高或酯化时间的延长，都会明显促进酰基转移；底物(油酸与甘油)摩尔比对酰基转移影响不大，但会影响DAG的得率；酶添加量在油-水反应界面达到饱和之前，酶添加量的变化对酰基转移的影响不大，当酶添加量达到饱和之后，进一步增加酶添加量，则会加剧体系的酰基转移。