基于SAFE-GC-O-MS的‘双红’干红葡萄酒关键香气物质分析

柴瑞雪，安朝严，刘 涛，孙延峰，吴广枫，石 英，段长青，兰义宾,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083；2.农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083；3.集安市人参特产业发展中心，吉林 通化 134000）

山葡萄（Vitis amurensisRupr.）是葡萄科葡萄属东亚种群中最抗寒的一个种，枝蔓能耐-40 ℃低温，根系可耐-15 ℃低温[1-3]。山葡萄资源丰富，性状多样性明显，在可溶性固形物、株产及单果质量方面表现良好，且药用及营养价值很高[3]。我国是世界上唯一拥有山葡萄两性花种质资源的国家，目前生产上主栽山葡萄品种为‘双红’、‘双优’、‘北冰红’、‘公酿一号’和‘左优红’等。‘双红’（原代号77-7-64）1998年通过吉林省农作物品种审定委员会审定并命名，其含糖量低、酸高、单宁高、色素含量高，浆果酿酒品质好，对霜霉病有极强抗性，产量高且稳定[1]，目前种植面积可达1万余亩。山葡萄作为酿酒原料已有70多年的历史，其中典型呈香物质是其有别于欧亚种的重要特征[4]。刘欢等[5]对‘双红’葡萄果实的总酚、总花色苷和香气成分进行了研究，结果表明‘双红’葡萄果实的总酚和总花色苷含量分别为130.61 mg/mL和294.62 μg/mL，从‘双红’葡萄果实中共检测出35种香气物质，其中酯类物质种类最多。冯晓辉等[6]以‘双红’和‘双优’为原料酿制的葡萄酒，颜色呈深宝石红，香气馥郁复杂，口感醇厚协调。姜自军等[7]采用气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用技术对‘28号’、‘双红’和‘双优’3个山葡萄品种的原酒中的风味组分进行研究，分别鉴定出46、47种和30种香气物质，但目前对‘双红’葡萄酒中香气物质种类和含量的研究尚不深入，且仅用GC-MS分析葡萄酒的香气物质，不足以全面说明葡萄酒的香气特征。

香气是葡萄酒的重要感官品质之一，决定产品的风格与典型性[8]。目前，在葡萄酒中共鉴定出1 300多种香气物质，含量从ng/L～g/L不等[9]。通常根据香气物质的来源将葡萄酒香气分为品种香、发酵香和陈酿香。直接来源于葡萄果实的香气称为品种香，常见的有萜烯类、C13-降异戊二烯类、吡嗪类和硫醇类等挥发性 组分[10]。发酵香是在葡萄酒乙醇发酵和苹乳发酵过程中产生的，如高级醇、脂肪酸乙酯、高级醇乙酸酯和中短链挥发性脂肪酸等[11]，主要来源于酵母的糖代谢和氨基酸代谢。葡萄酒陈酿阶段产生的香气物质称为陈酿香，主要指橡木来源的香气物质以及在储酒罐、橡木桶和酒瓶中经一系列化学反应形成的香气组分。

目前，GC-MS广泛应用于食品挥发性化合物的分析[12-14]。但是，食品中大量的挥发性组分只有小部分对香气有贡献，且它们的含量和阈值相对较低[15]，GC-MS仅能检测出挥发性组分的含量，无法确定单个挥发性组分对整体香气贡献的大小。感官组学分析技术能够有效分析鉴定食品的关键呈香化合物[16]，该方法采用气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfatometry，GC-O）技术对香气提取物进行稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）鉴定关键呈香物质，计算气味稀释因子（flavor dilution，FD），进而通过香气重构与缺失实验验证关键呈香物质对整体香气的贡献。目前，该方法广泛用于葡萄酒风味物质的研究[17-18]。例如，Ma Yue等[19]分析鉴定了中国‘威代尔’冰酒的特征香气，通过AEDA-GC-O法鉴定到28种FD大于9的关键香气物质，其中22种物质的香气活性值（odor activity values，OAVs）大于1；Wang Jiaming等[15]采用AEDA结合溶剂辅助风味蒸发（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）比较分析两款不同风格的澳大利亚桃红葡萄酒的关键呈香物质，共检测到51种FD大于3的香气化合物。感官组学分析技术现已成为鉴定某一食品关键呈香物质的有效 方法[16]。本研究将以鸭绿江河谷产区‘双红’干红葡萄酒为试材，利用液液萃取-溶剂辅助风味蒸发（liquidliquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLESAFE）技术萃取葡萄酒的香气物质，结合AEDA-GC-OMS技术鉴定‘双红’干红葡萄酒的关键香气物质，更系统地分析‘双红’干红葡萄酒的香气特征，以期为后续深入开展栽培和酿造技术调控‘双红’干红葡萄酒的风味品质研究提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘双红’干红葡萄酒样品为吉林省集安市鸭江谷酒庄有限公司商品酒（2016年）；NaCl、NaOH、葡萄糖和酒石酸（分析纯） 北京化学试剂公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（1 000 mg填料） 天津博纳艾杰尔科技有限公司；D-葡萄糖酸内酯、聚乙烯基吡咯烷酮和C6～C30正构烷烃 美国Sigma公司；香气标准品 美国Sigma公司和瑞士Fluka公司。

1.2 仪器与设备

嗅辨仪（olfactory detection port，ODP） 德国Gerstel公司；SAFE装置 德国Glasbläserei Bahr公司； 7890 GC气相色谱仪、5975B MS质谱仪 美国Agilent 公司；DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头 美国Supelco公司；HP-INNOWAX气相色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国J&W Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-O嗅闻分析

利用SAFE-AEDA和GC-O-MS联合技术分别对‘双红’干红葡萄酒游离态和结合态香气物质的萃取液进行分析。

LLE[20]：利用LLE技术直接萃取‘双红’干红葡萄酒游离态香气物质。取150 mL样品，加入NaCl至饱和，分别用80、40 mL和40 mL二氯甲烷溶剂萃取3 次，每次用磁力搅拌器提取10 min，用分液漏斗分离后合并有机相，得到‘双红’干红葡萄酒游离态香气提取液。

固相萃取（solid phase extraction，SPE）[21]：利用SPE技术提取‘双红’干红葡萄酒结合态香气物质。SPE柱活化后加入150 mL样品，用水洗脱，去除糖、酸等低分子质量极性化合物；加入25 mL二氯甲烷，去除游离态香气物质；加入30 mL甲醇，将糖苷结合态香气物质洗脱至50 mL圆底烧瓶中。将溶有结合态香气物质的甲醇溶液置于旋转蒸发仪上，于30 ℃旋转蒸干，加入45 mL柠檬酸/磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 5）溶解，再加入500 μL糖苷酶AR2 000（100 g/L）置40 ℃恒温箱中酶解16 h，酶解结束后，降温至4 ℃。利用LLE技术萃取上述溶液，得到‘双红’干红葡萄酒结合态香气提取液，萃取方法与游离态香气物质一致。

SAFE[22]：循环水浴及恒温水槽温度为50 ℃，系统真空度达1×10-6MPa时，向蒸馏瓶中滴入萃取液。SAFE装置收集瓶中提取液在室温下自然融化后，加入10 g无水硫酸钠干燥，于4 ℃冰箱中静置12 h后过滤，将有机相氮吹浓缩至1 mL，获得挥发性成分浓缩液。

AEDA[18]：样品浓缩提取液用二氯甲烷按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、…、1∶1 024的体积比逐步稀释，每组稀释液进行GC-O分析。每个样品及其每个稀释度均由3 名经过半年以上闻香培训的闻香员进行嗅辨分析，有2 位及以上闻香员嗅闻到的香味区域则计算其稀释因子。

GC-O-MS条件：HP-INNOWAX毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气，流速 1 mL/min；进样量1 μL；不分流进样；程序升温：起始柱温40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。进样口和辅助加热区的温度均为250 ℃。样品经色谱柱分离后以1∶1比例分别进入质谱和ODP进行检测。离子源为电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z30～350；质谱接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃。

1.3.2 香气物质的提取和定量分析

顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）[23-24]：利用HS-SPME方法萃取‘双红’干红葡萄酒游离态香气物质。20 mL样品瓶中准确加入5 mL样品、1 g NaCl、10 μL 4-甲基-2-戊醇水溶液（内标，0.989 8 g/L），在40 ℃条件下保持30 min；将已活化的萃取头插入样品瓶的顶空部分，在40 ℃下吸附30 min。

SPE[21]：利用SPE方法萃取‘双红’干红葡萄酒结合态香气物质。除样品量为40 mL外，SPE柱活化、样品洗脱与酶解步骤与GC-O分析中结合态香气物质的提取相同。酶解结束后，降温至4 ℃，一部分利用HS-SPME检测结合态香气物质，一部分利用SPE方法再次萃取并采用液体进样的方式检测结合态香气物质。再次萃取时，取40 mL酶解液加入SPE柱中，用10 mL水洗脱，去除一些糖、酸等低分子质量极性化合物后，用25 mL二氯甲烷将酶解液洗脱至50 mL圆底烧瓶中，加入1.5 g无水硫酸钠干燥脱水，10 μL 4-辛醇作内标，氮吹浓缩至1 mL，0.22 μm有机系微孔过滤膜过滤后以液体进样方式检测结合态香气物质。

GC-MS条件[23-24]：SPME进样采用不分流模式，程序升温：起始柱温50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。液体进样采用不分流模式，程序升温：起始柱温50 ℃，以7 ℃/min升至120 ℃，保持5 min；以2 ℃/min升至200 ℃；以10 ℃/min升至240 ℃，保持20 min。MS条件同GC-O-MS。

定性分析：采用自动质谱图解卷积和鉴定系统（AMDIS）软件进行峰识别，根据各物质的保留时间计算相应的保留指数（retention indice，RI）。香气物质的定性通过将该组分的RI与香气标准品的RI、质谱信息或美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）2011质谱数据库相匹配获得。

定量分析：采用内标标准曲线法进行定量分析，对于已有标样的香气物质，利用其标准曲线定量，对于没有标样的2-羟基己酸乙酯、棕榈酸乙酯、癸酸异戊酯、茶螺烷A、茶螺烷B、葡萄螺烷A和葡萄螺烷B这7种物质，利用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标样香气物质的标准曲线进行半定量[23-24]。

1.3.3 香气重构和缺失实验

香气重构实验[25]：筛选‘双红’干红葡萄酒中FD不小于8或OAV不小于1的42种重要香气物质进行香气重构实验。重构酒样以模拟溶液作为基质，按照上述42种香气物质的浓度进行添加重构。经5 名（2 男，3 女，年龄在23～28 岁之间）专业品评人员共同讨论得出6个用于‘双红’干红葡萄酒香气的描述性词汇，分别为生青味、黑色浆果、山楂味、烟熏味/动物味、脂肪味及煮蔬菜。选定描述词后，选择9 名（5 男，4 女，年龄在23～28 岁之间）评定员对‘双红’干红葡萄酒原酒及重构酒样的6个香气属性进行强度打分。打分采用10 点标度法（1 分代表香气非常不明显，10 分代表香气非常明显）。

香气缺失实验[25]：根据香气类型及化合物类别将上述香气化合物分成5 组，建立缺失模型，缺失样为缺失某一组分的重构溶液，对照样为重构酒样。选用18 名（10 男，8 女，年龄在23～28 岁之间）对香气描述及香气区分能力良好的评定员，根据三角检验法进行缺失实验。

1.4 数据处理

数据统计分析在SPSS 20.0中进行，采用Duncan测试法，P＜0.05，差异显著；所有图形采用OriginPro 2019绘制。

2 结果与分析

2.1 GC-O结果分析

利用GC-O-MS技术鉴定了‘双红’干红葡萄酒中游离态和结合态的关键呈香物质（表1），共鉴定到71个香气区域，每个香气区域均由2 位及以上的专业品评员共同嗅闻确定。其中47个香气区域能够实现香气物质的鉴定，但仍有24个香气区域无法实现鉴定，可能与上述化合物为痕量物质或存在共流出现象有关。

表1 利用AEDA-GC-O-MS鉴定‘双红’干红葡萄酒中关键 香气活性物质Table 1 Key aroma compounds identified in ‘Shuanghonng’ red wine by AEDA-GC-O-MS

续表1

鉴定到的游离态香气化合物中，包括挥发性酚类7种、脂肪酸乙酯类6种、脂肪酸类6种、高级醇类5种、C6醇类5种、内酯5种、醛酮类5种、硫化物2种、高级醇乙酸酯类2种、C13-降异戊二烯1种以及其他类2种。FD大于1 024的香气物质有β-大马士酮、己酸、β-苯乙醇和4-乙基苯酚。姜自军等[7]利用GC-MS从‘双红’葡萄酒中鉴定出47种香气物质，包括醇类、酯类、醛酮类等，而本研究首次在‘双红’干红葡萄酒中鉴定出了紫丁香酚、麦芽酚、间甲酚等物质。

高级醇类物质是葡萄酒中重要的风味化合物，是乙醇发酵阶段氨基酸转化和亚麻酸降解物氧化的主要产物。在‘双红’干红葡萄酒中共检测到高级醇类物质5种，其中β-苯乙醇具有最大FD（FD＞1 024），其次为异戊醇，FD达512。脂肪酸乙酯类物质主要表现为果香，其中辛酸乙酯的FD达512，除苯乙酸乙酯外，其他脂肪酸乙酯类香气物质的FD均在8～128之间。高级醇乙酸酯类物质主要贡献花香和果香，其中乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯的FD均不低于8。挥发性酚类物质中4-乙基苯酚具有最大FD（FD＞1 024），在嗅闻过程中表现为动物味、马厩味和皮革味；另外，4-乙烯基愈创木酚（李子干，肉桂）、丁香酚（李子干，香料）、愈创木酚（甜香，烟熏）和对甲酚（动物味）也都具有较大FD。脂肪酸类物质主要表现为脂肪味和酸腐味，其中己酸具有最大FD（FD＞1 024），除辛酸外，其他脂肪酸类香气物质的FD均在16～256之间。C13-降异戊二烯对葡萄果实的花香、果香贡献最大。本试验中嗅闻到的C13-降异戊二烯中FD最大的为β-大马士酮（FD＞1 024），嗅闻过程中表现为花香、甜香和蜂蜜味。C6醇类物质对香气的贡献也比较大，嗅闻过程中主要表现为生青味，1-己醇、顺式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、顺式-2-己烯醇、反式-2-己烯醇的FD均不低于8。

除上述物质外，‘双红’干红葡萄酒中还鉴定出了内酯、硫化物、醛酮类物质等，也对葡萄酒香气有较大贡献。内酯主要为γ-丁内酯（烘烤味，烤杏仁）、γ-己内酯（黄瓜，植物味）、γ-辛内酯（花香，椰子）和γ-壬内酯（甜香，焦糖味，果干），它们的FD均不低于8。硫化物在嗅闻过程中表现为煮土豆味，甲硫基丙醇和甲硫基丙醛的FD分别为8和128。醛酮类物质也称羰基化合物，既可能来源于果实，也可来源于微生物代谢，其中双乙酰表现为黄油味、酸奶味，FD达512；苯乙醛表现为玫瑰花香，FD为128。此外，麦芽酚（甜香，焦糖味）和香草醛（香草味）的FD均不低于8，对香气有一定贡献。

在未知化合物中，未知物1 534和未知物1 901的FD为256，而未知物2 246和未知物2 257的FD也可达128，对葡萄酒整体香气可能有较大贡献，但需要提高色谱的分离度或质谱的分辨率对未知嗅闻区域的物质进一步定性分析。

在结合态香气化合物中，共嗅闻到39个香气区域，其中23个香气区域可实现化合物的定性，与游离态香气物质相似，仍有16个香气区域未被鉴定。鉴定的23种香气物质中，包括挥发性酚类8种、内酯4种、脂肪酸类3种、高级醇类2种、醛酮类2种、C13-降异戊二烯1种、C6醇类1种、硫化物1种以及其他类1种。其中，β-苯乙醇（玫瑰，花香）、愈创木酚（甜香，焦糖味）、丁香酚（李子干，香料）具有最大的FD（FD＞1 024），其次为γ-壬内酯（甜香，焦糖味，果干），FD达512。另外，4-乙基苯酚、异丁子香酚、β-大马士酮、己酸、对甲酚、间甲酚、4-乙烯基愈创木酚、紫丁香酚、甲硫基丙醛、γ-丁内酯、香草醛、双乙酰、苯乙醛、异戊酸及14种未知化合物的FD也都不低于8。这些物质可能在后期陈酿过程中被释放出来，对葡萄酒香气有潜在影响。

2.2 香气化合物定量及OAV分析

通过GC-O技术实现对葡萄酒整体香气有潜在贡献的香气物质的鉴定，然而，这种方法没有考虑到葡萄酒基质对香气物质的影响，因此，运用GC-MS方法对‘双红’干红葡萄酒的香气化合物进行定量分析，结果如表2所示。‘双红’干红葡萄酒游离态香气化合物含量最高为乙酸，其次为异戊醇，质量浓度分别为 676 436.35 μg/L和177 114.44 μg/L，分别占香气物质总量的55.58%和14.55%。另外，乳酸乙酯、2,3-丁二醇、异丁醇、γ-丁内酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇、1-己醇、异丁酸、辛酸、己酸、癸酸、辛酸乙酯和丁酸质量浓度均超过

1 000 μg/L。

对定量的香气化合物进行OAV分析，具体结果见表2。OAV大于1的游离态香气化合物共有23种，包括脂肪酸乙酯类7种、脂肪酸类6种、高级醇类3种、醛酮类2种、高级醇乙酸酯类1种、其他酯类1种、C13-降异戊二烯类1种、C6醇类物质1种和硫化物1种。根据OAV结果发现，β-大马士酮（OAV=707.80）、苯乙醛（OAV=164.10）和己酸乙酯（OAV=112.20）的OAV较高，可能对‘双红’干红葡萄酒的香气特征有较大贡献。

表2 ‘双红’干红葡萄酒中香气物质的含量及OAV分析结果Table 2 Concentrations and OAVs of key aroma compounds in ‘Shuanghong’ red wine

续表2

高级醇类物质中的异戊醇、β-苯乙醇、异丁醇和脂肪酸类物质中的辛酸、己酸、乙酸的OAV均大于1。虽然乙酸和异戊醇的含量最高，但其OAV并不高，仅为3.38和2.72，说明香气化合物的含量并不能完全反映其对葡萄酒香气的贡献。高级醇类物质是酵母乙醇发酵的副产物，也是葡萄酒中主要香气物质之一，这类物质常具有较为强烈的刺激性气味，能够赋予葡萄酒更为复杂的香气[26]。研究报道，选用山葡萄品种‘左山一’酿造的葡萄酒中异丁醇、苯乙醇质量浓度较高，分别为50.36 mg/L和67.99 mg/L[27]，一定含量的醇类物质能够提升其整体香气的复杂性，但质量浓度超过400 mg/L时可能会影响葡萄酒香气的协调性。

葡萄酒中酯类物质的含量常超过其感官阈值，可以赋予葡萄酒浓郁的果香和甜香。本实验中鉴定出的酯类物质主要为脂肪酸乙酯类，质量浓度在7.59～115 387.46 μg/L之间，其中己酸乙酯具有最大的OAV，达112.20；另外，乙酸异戊酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯的OAV均大于1。这与相关研究报道一致，刘欢等[28]对山葡萄品种‘双优’酿造的葡萄酒中挥发性香气成分进行了分析，共检出酯类物质28种，其中乙酸乙酯的质量浓度最高，达42.43 mg/L，且乙酸乙酯、丁酸乙酯等8种酯类物质的OAV均大于1，可能对酒样的花香、甜果香有较大贡献。

β-大马士酮是葡萄酒中重要的香气化合物，广泛存在于水果及各类葡萄酒中，一般葡萄酒中质量浓度在0.1～10 μg/L之间[29]，在‘双红’干红葡萄酒中质量浓度为35.39 μg/L，由于它在酒中的阈值低，仅有0.05 μg/L， 所以β-大马士酮具有最大OAV，高达707.80，与GC-O分析中该物质具有较高的FD一致。醛酮类物质苯乙醛的OAV仅次于β-大马士酮（OAV=161.40），而该物质在GC-O分析中也具有较大的FD。上述结果表明β-大马士酮与苯乙醛对‘双红’干红葡萄酒的香气贡献较大。

在GC-O分析中，愈创木酚、丁香酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基苯酚的FD均不低于64，但其OAV均小于1。另外，辛酸、癸醛、乳酸乙酯、癸酸乙酯的FD均小于8，但它们的OAV均超过1。由此可见，在GC-O稀释分析与OAV分析鉴定重要化合物时存在一定差异。

结合态香气化合物中含量最高的为4-乙烯基愈创木酚，其次为γ-丁内酯和异戊醇，质量浓度分别为3 417.21、2 227.2 μg/L和2 217.61 μg/L，分别占结合态香气物质总量的21.63%、14.10%和14.03%。另外，结合态香气物质中，乙酸、辛酸和癸酸质量浓度也超过1 000 μg/L。Lan Yibin等[30]的研究表明我国刺葡萄中结合态香气化合物主要是高级醇、挥发性酚、C6醇和萜类化合物，其中糖苷结合态的挥发性酚类物质含量高于游离态。‘双红’干红葡萄酒中OAV大于1的结合态香气化合物共有10种，包括挥发性酚类4种、脂肪酸类2种、醛酮类2种、硫化物1种和C13-降异戊二烯类1种。其中结合态的β-大马士酮具有最大OAV，为267.80，然后依次为苯乙醛（OAV=8.83）、丁香酚（OAV=5.74）、异丁子香酚（OAV=5.02）、4-乙烯基愈创木酚（OAV=3.11）、辛酸（OAV=2.24）、癸酸（OAV=1.59）、癸醛（OAV=1.54）、愈创木酚（OAV=1.18）和甲硫基丙醛（OAV=1.10）。这些结合态香气物质本身不具有挥发性，对葡萄酒的香气没有直接贡献，但在发酵或陈酿过程中可通过酸解与酶解释放出具有挥发性的糖苷配体，从而间接影响葡萄酒的香气[31]。

2.3 香气重构与缺失实验结果分析

FD和OAV的分析结果确定了影响葡萄酒香气的关键香气物质，然而，挥发性化合物之间的相互作用没有被考虑在内。为了验证上述主要香气化合物对‘双红’干红葡萄酒整体香气的贡献，对原酒及香气重构酒样进行定量描述分析。采用FD不小于8或OAV不小于1的42种香气物质进行香气重构分析（表1、2），重构酒样由模拟溶液与42种化合物组成。如图1所示，在6种香气中，生青味、黑色浆果和烟熏味/动物味有较强的香气强度，而山楂味、脂肪味和煮蔬菜不太明显。另外，通过重构实验发现重构酒样与原酒样相比，香气轮廓基本一致，但是重构酒样中生青味、黑色浆果及脂肪味、煮蔬菜的香气强度均低于原酒样，可能是由于在GC-O分析实验中，存在许多未被鉴定的FD较大的嗅闻区域，而这些化合物未被添加进重构酒样所造成。

图1 ‘双红’干红葡萄酒原酒样与重构酒样香气轮廓分析Fig. 1 Aroma profile analysis of ‘Shuanghong’ red wine and reconstituted wine

为了验证上述香气化合物对‘双红’干红葡萄酒香气轮廓的影响，根据香气类别及化合物类型将上述香气化合物分成5 组，建立5 组缺失模型，缺失物质分为酯类物质、β-大马士酮、挥发性酚类物质、C6醇类物质和脂肪酸类物质（表2）。分别缺失这5 组香气化合物，通过三角检验对比缺失香气与未缺失香气的重构样之间是否存在差异，确定其对葡萄酒整体香气的贡献，缺失实验结果如表3所示。结果表明，酯类物质、β-大马士酮及C6醇类物质的缺失组与未缺失组之间存在极显著差异（P≤0.001）。挥发性酚类物质显著影响‘双红’干红葡萄酒的香气感知（P≤0.01），这些物质主要赋予葡萄酒烟熏味、香料味及动物味，这类香气在重构时也与原酒轮廓较为相似，进一步说明挥发性酚类物质是‘双红’干红葡萄酒的特征香气物质。脂肪酸类物质对酒的香气感知也有显著影响（P≤0.05），在嗅闻过程中主要表现为脂肪味、酸腐味，虽然不是‘双红’干红葡萄酒主要的香气轮廓，但缺失检验显示其对酒的香气存在影响。

表3 ‘双红’干红葡萄酒缺失实验结果Table 3 Omission test results of ‘Shuanghong’ red wine

3 结 论

本实验采用LLE-SAFE对‘双红’干红葡萄酒的游离态和结合态香气物质进行萃取，通过GC-O-MS分析共嗅闻到71个香气区域，实现46个游离态和23个结合态香气物质的鉴定。游离态香气物质中，FD大于1 024的组分有β-大马士酮、己酸、β-苯乙醇和4-乙基苯酚；结合态香气物质中，FD大于1 024的组分有愈创木酚、β-苯乙醇和丁香酚。OAV分析结果表明，有23种游离态香气化合物的OAV大于1，其中具有高OAV的香气物质有β-大马士酮（OAV=707.80）、苯乙醛（OAV=164.10）和己酸乙酯（OAV=112.20）。通过香气重构技术和感官定量分析基本证实了鉴定到的42种香气物质是‘双红’干红葡萄酒的主要呈香物质，但是重构酒样的生青味和黑色浆果香气强度显著低于原酒，仍有待进一步研究。此外，利用缺失实验进一步证实了脂肪酸乙酯类、β-大马士酮、C6醇类和挥发性酚类物质对‘双红’干红葡萄酒的香气感官特征有显著影响。本研究通过鉴定‘双红’干红葡萄酒的关键呈香物质，为通过栽培技术定向改善原料的质量、利用酿造技术提升产品风味品质提供了理论依据。