银杏叶提取物对糖尿病肾病大鼠肾功能、心功能、炎性反应、β2-MG及RBP4水平的影响

江梅，刘曙艳，牛万彬

（焦作市第二人民医院，河南 焦作 454150）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）在临床上最常见的慢性并发症之一，主要症状表现为高血糖、胰岛素分泌缺乏及代谢紊乱等，易造成机体微循环障碍、刺激机体炎症反应，严重时可引起终末期肾脏疾病，影响患者的治疗及预后［1-2］。目前，临床关于DN 的发生机制尚未完全明确，但较多研究指出其与糖代谢紊乱、血脂代谢异常、炎性反应等密切有关。且近年来较多研究发现，肾小管损伤与DN 进展及预后关系密切，因此早期干预治疗具有十分重要的作用［3］。黄酮类、萜类内酯为银杏叶提取物（GBE）的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及心肌保护等药理作用，因此被广泛应用于心脑血管疾病的治疗［4-5］。目前，临床关于GBE 在DN 中的临床研究较多，但大都集中于DN 肾功能及炎性反应方面，关于GBE 对DN 肾小管功能的作用研究较少［6］。为进一步探究GBE对DN的防治效果，本研究从肾功能、肾小管、炎性反应及心功能等方面出发，观察GBE 干预下DN 大鼠体内肾功能、肾小管、炎性反应及心功能的变化，为临床DN 的防治提供参考，结果如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选取健康8周龄雄性SD（清洁级）大鼠36只，实验前所有大鼠均进行适应性喂养，为期1周，室内分组笼养，控制室温为（22 ± 2）℃，并在8∶00—20∶00 时间段进行自然光线或开灯照射，其余时间均关灯。实验大鼠均为专人负责喂养，饮水自由，喂养饲料和饮用水的量均依照大鼠成长速度进行调节。实验大鼠及喂养饲料均购自福州福医大实验动物有限公司。

1.2 实验试剂及器材

1.2.1 试剂及药品

链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）；银杏叶片（每片含黄酮醇苷9.6 mg 及萜类内酯2.4 mg，国药准字Z20053069，海口奇力制药股份有限公司，9.6 mg ×24 s）；24 h 尿蛋白（货号：C035-2）、BUN（货号：20160511）、Cr（货号：C011-2）、IL-6（货号：000004）、IL-8（货号：L00417）、TNF-α（货号：YM-S0122）、β2-MG（货号：KGE019）及RBP4（货号：DRB400）试剂盒均购自上海博湖生物科技有限公司。

1.2.2 主要仪器设备

德国Simens 公司Acuson Sequoia512C 彩色多普勒超声诊断系统（配备15L8w-S 线阵探头，频率为12～14 MHz）；超速低温离心机；精密电子天平；日立7600全自动生化分析仪（日本）。

1.3 分组及造模

36 只雄性大鼠，体质量200～250 g，随机分为3 组，分别为对照组、糖尿病肾病模型组（DN 组）及银杏叶提取物干预组（DN + GBE 组），每组12 只。对照组不予造模，DN 组及DN + GBE 组均参照2015年Elsherbiny 建模方法完成DM 诱导DN 模型。然后对DN 组及DN+GBE 组一次性腹腔注射STZ 溶液（由pH值为4.5 的柠檬酸钠缓冲液配置而成），注射剂量为60 mg/kg。对照组大鼠采用等体积pH 值为4.5的缓冲液注射。建模48 h后，检测大鼠空腹血糖，血糖水平超过250 mg/dL的大鼠视为糖尿病造模成功。

1.4 给药方法

DN + GBE 组给予GBE 干预，灌胃前使用蒸馏水将药物稀释，剂量为96 mg/kg；对照组及DN 组给予同等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续12周。

1.5 观测指标

1.5.1 大鼠一般情况

实验期间，观察各组大鼠饮水情况、进食情况、尿量、体质量及精神状况等。

1.5.2 肾功能指标水平

分别在干预第4、8、12 周将大鼠置于代谢笼中，收集大鼠尿液进行24 h 尿蛋白定量检测；同时采集大鼠主动脉血，抗凝处理，离心，分离血清，并保存于-20 ℃备测，尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）采用日立7600 全自动生化分析仪检测。

1.5.3 炎性因子水平

白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-α）均采用ELISA 法在干预4、8、12 周后检测。

1.5.4 心功能指标情况

左室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）采用彩色多普勒超声诊断仪在干预4、8、12 周后检测。

1.5.5 肾小管损伤标志物水平

分别在干预4、8、12 周后，收集大鼠尿液，采用ELISA 法检测β2-MG 及RBP4 水平。以上操作均按照试剂盒标准严格进行。

1.6 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件处理数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，不同时点计量资料采用重复测量方差分析，以P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能指标水平比较

时点比较，干预4、8、12 周时3 组的24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平差异均无统计学意义（P ＞0.05）；组间比较，对照组24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平低于DN +GBE 组（P＜0.05），DN + GBE 组24 h 尿蛋白、BUN 及Cr水平低于DN组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点肾功能指标水平比较（±s）

表1 各组大鼠不同时间点肾功能指标水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与DN组比较，bP ＜0.05；与干预4周比较，*P ＜0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点，P值F交互，P值F组间，P值n 12 12 12时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周24 h尿蛋白（mg/24 h）5.67±1.68 5.56±1.72 5.49±1.75 12.45±2.98a 14.78±3.09a 16.11±3.27a*9.71±2.30ab 8.42±2.26ab 7.89±2.12ab 3.527，0.069 30.375，0.000 54.078，0.000 BUN（mmol/L）9.12±2.66 9.64±2.56 9.02±2.58 23.45±6.45a 24.12±6.60a 25.68±6.85a 17.68±3.54ab 16.32±3.25ab 15.78±3.12ab 0.019，0.891 4.661，0.016 42.283，0.000 Cr（µmol/L）9.34±1.88 9.87±1.94 9.41±1.81 24.08±4.14a 26.54±4.26a 28.80±4.91a*22.10±3.44ab 20.12±3.56ab 17.78±3.68ab*0.088，0.769 24.391，0.000 111.504，0.000

2.2 炎性因子水平比较

时点比较，干预4、8、12周时3组的IL-6、TNF-α水平差异均无统计学意义（P ＞0.05）；组间比较，对照组IL-6、TNF-α 水平低于DN + GBE 组（P＜0.05），DN + GBE 组IL-6、TNF-α 水平低于DN 组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点炎性因子水平比较（±s，n=12）

表2 各组大鼠不同时间点炎性因子水平比较（±s，n=12）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与DN 组比较，bP ＜0.05；与干预4 周比较，*P ＜0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点，P值F交互，P值F组间，P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周IL-6（µg/L）3.02±0.29 3.16±0.36 3.21±0.38 15.12±2.68a 16.89±2.82a 18.71±2.94a*9.62±3.13ab 8.42±3.04ab 7.89±2.96ab 2.406，0.130 12.469，0.000 144.474，0.000 TNF-α（mg/L）2.45±0.45 2.67±0.39 2.56±0.48 9.45±2.28a 9.86±2.14a 10.32±2.09a 6.12±1.56ab 5.28±1.46ab 4.68±1.32ab*0.416，0.523 8.178，0.001 96.238，0.000

2.3 心功能指标比较

时点比较，干预4、8、12周时3组的LVEF、LVFS值差异均无统计学意义（P ＞0.05）；组间比较，对照组LVEF、LVFS 值高于DN + GBE 组（P＜0.05），DN +GBE 组LVEF、LVFS 值高于DN 组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点心功能比较（±s，n=12）

表3 各组大鼠不同时间点心功能比较（±s，n=12）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与DN组比较，bP ＜0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点，P值F交互，P值F组间，P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周LVEF（%）82.67±3.45 82.12±3.67 82.73±3.94 71.24±5.72a 70.68±5.84a 70.79±5.84a 77.95±3.47ab 76.42±3.14ab 78.12±3.24ab 0.019，0.890 0.130，0.878 26.900，0.000 LVFS（%）47.66±3.98 47.12±4.06 47.05±4.11 36.89±4.42a 36.95±4.08a 36.13±4.16a 41.22±3.30ab 41.08±3.40ab 42.45±3.24ab 0.008，0.928 1.543，0.229 29.270，0.000

2.4 β2-MG及RBP4水平比较

时点比较，干预4、8、12 周时3 组的β2-MG 差异均具有统计学意义（P＜0.05），RBP4 水平差异无统计学意义（P ＞0.05）；组间比较，对照组β2-MG、RBP4水平低于DN + GBE 组（P＜0.05），DN + GBE 组β2-MG、RBP4水平低于DN组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠不同时间点β2-MG及RBP4水平比较（±s，n=12）

表4 各组大鼠不同时间点β2-MG及RBP4水平比较（±s，n=12）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与DN 组比较，bP ＜0.05；与干预4 周比较，*P ＜0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点，P值F交互，P值F组间，P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周β2-MG（mg/L）6.12±1.60 6.45±1.54 6.52±1.66 56.78±7.88a 28.32±7.96a 31.19±8.42a*20.96±5.09ab 18.45±5.21ab 16.08±5.15ab*155.440，0.000 97.323，0.000 157.309，0.000 RBP4（mg/L）10.88±2.96 11.42±3.12 11.73±3.09 27.78±5.42a 29.45±6.12a 31.66±6.65a 17.90±4.17ab 16.32±4.24ab 15.78±4.08ab 1.521，0.226 6.030，0.006 67.659，0.000

3 讨论

DN 为DM 患者常见并发症之一，近年来发病率逐年攀升。相关资料指出，DN是造成患者终末期肾病的重要原因，其地位仅次于肾小球肾炎，发生后可引起患者肾功能损伤，严重时可导致尿毒症，增加疾病病死率［7-8］。目前关于DN 的发病机制尚未完全明确，其早期主要表现为基底膜肥厚及肾血流增加，经进展可表现为蛋白排泄增加、肾小球硬化及肾脏炎症，造成肾功能障碍。既往研究发现，血糖、血脂、氧化应激反应等与DN的发生及发展密切相关，DN疾病初期，炎性细胞可在肾小球中积聚，可能参与DN 的发病过程［9-10］。故现阶段改善患者肾功能及心功能、降低炎症反应为DN治疗的关键点。银杏叶性味苦、涩、平，具有活血止痛及保护心脑血管等作用。银杏叶提取物为银杏叶中提取的有效成分，包含黄酮类、有机酸类及萜类内酯等活性成分，具有抗氧化应激、抗血小板、抑制肾小管细胞凋亡及改善微循环等作用［11］。有研究指出，银杏叶提取物可有效清除机体自由基，具有抑制毛细血管通透性，改善机体新陈代谢及末梢血液循环障碍等作用［12］。

高糖状态下，肾小球微循环受到损害，可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，进一步促进NO 的代谢，造成内源性血管舒张，损伤内皮细胞及肾小球［13］。据文献报道，肾小球肾病以蛋白尿增多及肾功能参数变化为主要特征，因此可升高BUN 及Cr 水平，降低肌酐清除率；且在炎症反应的刺激下，炎性因子聚集于肾小球及间质中，可加重DN 肾损伤［14］。庞欣欣等［15］研究发现，DN 患者微量蛋白尿升高之前，其肾小管损伤标志物会出现异常升高，提示DN 患者肾小管病变要早于肾小球损伤。基于这一结论，近年来较多研究者指出，除肾小球指标可较为准确预测DN 患者肾功能外，肾小管标志物对DN 肾功能预测的敏感性也较高。β2-MG 及RBP4 均为灵敏的肾小管损伤标志因子，其可从肾小球中自由滤过，且绝大部分在近端肾小管中被吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏，因此正常情况下β2-MG 的排出量较少。另有研究指出，β2-MG、RBP4 与DN 患者Cr 及尿微量白蛋白呈正相关。本研究中，干预4、8、12 周后对照组24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平均低于低于DN + GBE 组，DN+GBE 组24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平低于DN 组。提示GBE 可有效改善DN 模型大鼠肾功能，改善大鼠肾脏组织结构，降低细胞坏死及基底膜增厚，进而发挥肾脏的保护作用。

炎症因子在DN 发生中的作用机制已得到证实。IL-6 为机体促炎细胞因子，可刺激肝细胞合成，从而生成急性期蛋白，参与炎症反应。已有研究指出，IL-6 可促进机体白细胞吞噬能力的提高，进一步增加毛细血管通透性，进而造成微量白蛋白增高。IL-6还可降低胰岛β 细胞功能，降低胰岛素，促使DN 发生［16］。而hs-CRP 为急性反应蛋白，可引起机体氧化应激反应，损伤肾小球内皮细胞，并进一步导致动脉硬化，促进DN 形成。TNF-α 为DN 的重要介质，其水平可随DN 病程的延长而升高，并可促进胰岛素抵抗，造成机体氧化自由基反应，加重DN 患者肾功能损伤［17］。一项国外研究指出，IL-6、hs-CRP 与纤维蛋白原的关系密切［18］。本研究中，干预4、8、12 周后对照组IL-6、TNF-α 水平均低于低于DN+GBE 组，DN+GBE 组IL-6、TNF-α 水平低于DN 组。提示GBE 可有效改善DN模型大鼠炎性反应，在DN形成中具有抗炎作用。

DM 主要为胰岛素缺乏、生物活性受损及代谢紊乱引起，可造成心血管、肾脏及神经等一系列组织损害。DN 为DM 的严重并发症，若未及时进行有效治疗，可并发尿毒症，增加死亡风险。有研究指出，DM可引起心肌细胞凋亡，造成心肌顺应性改变，影响心功能，也可能参与DN 的发病过程［19］。本研究结果显示，DN + GBE 组LVEF、LVFS 值高于DN 组。证实GBE 组大鼠心室收缩功能显著改善，提示GBE 具有减少心肌细胞凋亡、改善大鼠心功能作用。

综上所述，银杏叶提取物可有效改善DN 大鼠肾功能及心功能，并减轻大鼠肾小管损伤，减少炎症因子释放。