穴位注射温敏水凝胶对坐骨神经痛大鼠的效果及应用

卫弯，姚勇，杨华元

（上海中医药大学，上海 201203）

羊肠线是临床上最常用的穴位埋线材料之一，具有一定的治疗作用，但存在功能单一、埋植工具成本高、部分患者对其过敏等问题［1-2］。具有三维网络结构的水凝胶材料因其良好的生物相容性、生物可降解性、可注射性以及药物缓释作用，已逐渐成为穴位埋植材料的首选之一［3-4］。本研究从生物相容性良好的可注射CS/GP 水凝胶在室温下呈液态、37 ℃下可固化的特点出发，同时装载地塞米松（DXM），不仅可以通过使药物缓释以减少直接给药的副作用，注射后还可以通过溶胶-凝胶转变的方式粘附于穴位进行持久刺激。基于此，本研究通过比较其与羊肠线埋线法对坐骨神经痛大鼠的治疗效果，挖掘其镇痛机制，并探索其是否可作为穴位埋线的替代材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康清洁级SD 大鼠，体质量（200±20）g，购于上海中医药大学，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0006。饲养在上海中医药大学实验技术中心，饲养条件为光照周期12 h/12 h，室温22～25 ℃，相对湿度45%～60%。大鼠自由进食、饮水，整个实验过程遵照中华人民共和国科技部2016年颁布的《有关动物的使用及伦理学规定》。

1.2 主要仪器和试剂

壳聚糖（CS，货号：C105799，中国上海阿拉丁公司）；盐酸溶液（批号：10011028，国药集团）；β-甘油磷酸酯（β-GP，批号：D106347，上海阿拉丁科技有限公司）；DXM（货号：60231A，Adamas）；水浴锅（HH-S单孔，长城）；大鼠ELISA 试剂盒TNF-α（批号：xy-E1275，上海信裕生物科技有限公司）；大鼠ELISA试剂盒IL-1β（批号：xy-E12689，上海信裕生物科技有限公司）；兔抗Iba1 抗体（货号：#17198，CST）；羊抗P2X4R 抗体（货号：ab134559，Abcam）；2450 型爪痛觉测试仪（美国IITC Life Science 公司）；荧光显微镜（ECLIPSE Ni，NIKON公司）。

1.3 水凝胶的制备

在连续磁力搅拌下，将CS（200 mg，脱乙酰度为90%～95%，分子量中等）中加入盐酸溶液（配制浓度0.1 mol/L，10 mL）2 h，随后在连续搅拌下逐滴加入β-GP 溶液（56% W/V，2 mL）。将DXM（12 mg）溶解在上述CS/GP溶液中。

1.4 分组、造模与干预

将40 只健康雄性SD 大鼠随机分为对照组（Control 组）、模型组（CCI 组）、羊肠线埋植组（Catgut组）、CS/GP 组和CS/GP/DXM 组，每组各8 只。除Control组外，对其余组大鼠进行CCI造模。

CCI 大鼠模型的建立：SD 大鼠于造模前1 d 禁食、禁水，腹腔麻醉（0.3% 戊巴比妥钠，给药剂量为1 mL/100 g）。麻醉成功后，在大鼠右腿后侧中部进行消毒，铺无菌巾，切开皮肤约2 cm，钝性分离股二头肌，暴露右坐骨神经中段。用4-0丝线松散结扎4次，每次结扎间隔1 mm，松紧度以结扎丝线能在坐骨神经干上滑动，大鼠肌肉轻微颤动为宜。密切观察大鼠的生命体征和伤口愈合情况。

造模完成后，CS/GP 组和CS/GP/DXM 组分别在足三里（ST36）穴处注射0.1 mL 相应水凝胶，Catgut 组在足三里穴处埋植2 mm 左右羊肠线。各治疗组均每周进行1次治疗。

1.5 检测指标

1.5.1 温敏性实验

水凝胶的温敏性通过玻璃瓶倒置方法进行测试，控制温度在37 ℃左右时进行，将玻璃瓶倾斜放置30 s后，若溶液不再流动，意味着溶液已完全转化为凝胶。

1.5.2 生物相容性

将12 只雄性SD 大鼠随机分为对照组（PBS 组）、CS/GP 组与CS/GP/DXM 组，每组各4 只。对照组大鼠在第7 颈椎的椎体处（颈部和背部的交界处）皮下注射200 µL 的PBS；CS/GP 组与CS/GP/DXM 组大鼠在与阴性对照组相同的解剖部位注射200µL 相应的水凝胶。2 周后取注射处皮肤组织，在4%的聚甲醛（PFA）中固定2 d，在一系列乙醇中脱水后，嵌入石蜡中，切3 µm的厚片，然后进行HE 染色，通过HE 染色评价水凝胶的相容性。

1.5.3 行为学评价

机械刺激缩足反射阈值（PMWT）测定：术前和术后第1、3、5、7、10、14 天用电子Von Frey 痛觉测试仪测量SD 大鼠的右后爪痛觉。将大鼠放在笼子里30 min，当大鼠安静时，逐渐对手术侧的脚底施加压力，直到出现抬脚、避让或舔脚等动作。记录出现阳性反应时施加在脚底的最大压力，并以5 min 为间隔重复测量3次。

1.5.4 ELISA检测方法

采用ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α 与IL-1β的表达。术后第14 天对大鼠进行麻醉，钝性分离组织器官，暴露腹主动脉，从腹主动脉采集5 mL 血液，4 ℃下3 000 r/min 离心15 min，用吸管吸出上清液。严格按照ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.5.5 免疫荧光技术检测脊髓L4～L6背角的Iba1 及P2X4R的表达量

术后第14 天对大鼠进行麻醉后取材，取材部位为L4～L6脊髓节段，多聚甲醛中固定2 h 后，在含有25%蔗糖的0.1 mmol/L PBS 中保存48 h，在冷冻切片机上切片。室温封闭1 h 后，分别加入稀释浓度为1∶1 000的一抗（Iba1 与P2X4R），4 ℃下15 h 后，将切片用0.01 mol/L PBS 洗3 次，滴加二抗与显色剂，于显微镜下观察。

1.6 统计学方法

所有实验数据均使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，并使用GraphPad Prism 5.01 绘图。采用双变量方差分析和邦弗朗尼Bonferroni 事后检验比较各组在不同时间点的PMWT；采用单因素方差分析对各组生化指标进行比较。数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的温敏性实验结果

温敏性实验结果表明，CS/GP 在室温下为淡黄色透明液体，流动性好，液面随试管的倾斜而变化，溶液状态有利于它的可注射性；在37 ℃以上的水浴中加热5 min 后，CS/GP 液体迅速转变为凝胶状固体，附着在试管壁上，呈淡黄色，性质均匀，浑浊不透明，试管倾斜时凝胶固定，失去流动性，注射于穴位后可以凝固成胶状粘附于穴位，达到长时程刺激穴位的作用。见图1。

2.2 水凝胶生物相容性结果

CS/GP 和CS/GP/DXM 水凝胶注射在SD 大鼠体内后并未发生挤压变形等情况，且在皮肤组织下很好地形成了胶体。SD 大鼠的生理温度约为37 ℃，可以清楚地观察到，水凝胶可在其背部皮肤上形成凝胶，失去流动性，并与周围组织粘连，而且没有观察到局部发红、肿胀或坏死等炎症反应，可以实现对穴位的持续长时间刺激，见图2 a1～a3。HE染色发现，水凝胶在大鼠皮下与周围组织有良好的分界和固定性，见图2 b1～b3。在水凝胶注射部位周围的皮肤组织中可以观察到清晰的界限。结果表明水凝胶具有良好的生物相容性，可用作穴位埋植的可替代材料之一。

2.3 各组大鼠PMWT结果比较

各组大鼠造模前PMWT 的基础测量值并无差异。单侧坐骨神经结扎后，CCI 组大鼠在1 d 内同侧后爪出现明显的痛觉过敏，并持续了约14 d。而Control组同侧后爪的PMWT 可以保持稳定14 d。注射CS/GP/DXM 水凝胶后第1 天，大鼠的PMWT 即开始增加，并在14 d 内有明显改善。此外，在第1 天治疗后到第14 天治疗结束时，与CCI 组、Catgut 组比较，在这些不同的治疗时间点上CS/GP/DXM 组的PMWT 均明显提高（P＜0.001），而CS/GP 组和CCI 组差异无统计学意义。结果表明载药水凝胶在一定治疗剂量范围内可以明显缓解CCI 大鼠的痛敏情况。见表1和图3。

表1 各组大鼠治疗后PMWT结果比较（±s，g）

表1 各组大鼠治疗后PMWT结果比较（±s，g）

注：与CCI组比较，***P ＜0.001；与Catgut组比较，&&&P ＜0.001。

组别Control组CCI组Catgut组CS/GP组CS/GP/DXM组造模前49.73±2.34 47.59±4.10 49.35±5.37 46.93±5.32 50.27±3.73术后第1天46.55±4.05 19.86±1.50 22.48±2.19 20.30±1.61 36.12±2.32***&&&术后第3天48.78±3.80 17.67±1.13 21.99±1.78 19.92±1.31 33.00±2.23***&&&术后第5天44.46±2.83 16.78±1.91 22.85±2.31 19.22±2.45 33.07±2.06***&&&术后第7天47.22±4.20 15.84±1.85 23.04±2.27 19.13±2.13 34.55±2.29***&&&术后第10天46.51±3.11 17.26±1.92 22.75±2.08 18.05±1.87 36.59±4.63***&&&术后第14天48.06±4.00 17.38±1.89 24.94±2.88 18.68±3.23 38.65±2.32***&&&

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β表达情况比较

与对照组比较，CCI 组和CS/GP 组大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的表达明显增加（P＜0.001）。与CCI 组和CS/GP 组比较，Catgut 组TNF-α 和IL-1β的表达水平下降（P＜0.001，P＜0.01）。与CCI 组比较，CS/GP/DXM 组大鼠血清中TNF-α 与IL-1β的表达明显降低（P＜0.001），且低于Catgut 组（分别为P= 0.049，P= 0.013）。结果表明，CS/GP/DXM水凝胶在持续的药物释放下，可通过降低血清中TNF-α、IL-1β 的表达水平来抑制神经性疼痛的全身免疫反应，其效果优于没有载药的Catgut 组。见表2。

表2 各组大鼠治疗后血清中TNF-α、IL-1β比较（±s，ng/L）

表2 各组大鼠治疗后血清中TNF-α、IL-1β比较（±s，ng/L）

注：与Control 组比较，***P ＜0.001；与CCI 组比较，##P ＜0.01，###P ＜0.001；与CS/GP 组比较，&&P ＜0.01，&&&P ＜0.001；与Catgut 组比较，△P ＜0.05。

组别Control组CCI组CS/GP组Catgut组CS/GP/DXM组n4 4 4 4 4 TNF-α 81.28±14.84 154.69±8.19***141.11±11.87***99.50±11.56&&&###81.39±9.72&&&###△IL-1β 9.40±1.55 20.02±2.15***19.65±2.65***14.31±1.54&&##10.56±0.82&&&###△

2.5 各组大鼠脊髓L4～L6背角Iba1 及P2X4R 表达量比较

与对照组比较，CCI 模型后SD 大鼠脊髓背角上P2X4R+以及Iba1+细胞数明显增加。经CS/GP/DXM水凝胶注射治疗2 周后，大鼠脊髓背角P2X4R 表达减少；与Catgut 组比较，Iba1+小胶质细胞数量被明显抑制。见图4。

3 讨论

本次研究中制作的两种可注射的CS/GP 水凝胶和CS/GP/DXM 水凝胶均具有良好的生物相容性、可注射性、温敏性以及可载药性，优于功能单一的羊肠线。结果显示，CS/GP/DXM水凝胶可通过降低血清中TNF-α、IL-1β 的表达水平、抑制脊髓背角上小胶质细胞的活化以及P2X4R 的表达而发挥其镇痛作用，且治疗效果优于羊肠线。

温敏性水凝胶的优点是制备方法简单，且不需要进行手术，常温下（25 ℃）水凝胶呈溶液状态，具有可注射性，在接近人体生理温度下（37 ℃）即可成胶，降解时间较长，可在一定程度上改善传统羊肠线埋线治疗方式，减少埋植次数，降低成本。此外，可注射水凝胶的剂量便于控制，疗效肯定，在穴位埋线疗法的材料选择中具有很大的应用前景。壳聚糖是一种被广泛研究的多糖，甘油磷酸酯（GP）的加入能使其成为热敏性水凝胶，实现溶胶-凝胶的转变［5］。这种水凝胶可以通过简单的混合得到，而且与周围的组织能很好地相容，对临床治疗有一定的参考价值。穴位埋线疗法在临床治疗中的应用广泛，如治疗各种急慢性及难治性疾病，这种疗法与普通针灸比较，具有刺激持久、治疗次数少、依从性好等优点［2］。羊肠线是临床上最常用的埋植材料，目前仍有部分患者对羊肠线过敏，因此其他高分子材料的开发和应用具有很大潜力［6-7］。研究表明，穴位注射壳聚糖线被人体吸收后，能够对穴位及周围组织产生较长时间的生理、生化反应，可达20日或以上［8］。因其可降解性缓慢，注射水凝胶治疗能减少穴位埋植次数，简化操作，同时，其载药性还能增强治疗作用，采用这种可注射水凝胶进行治疗不仅能改进埋线工具、减少患者的痛苦，还可以降低治疗成本。

CCI 模型是常见的神经病理性疼痛动物模型，神经结扎2 周后，CCI 大鼠表现出自发性疼痛、热敏痛和机械热敏痛，疼痛高峰约在第14 天，因此CCI 模型是模拟慢性神经病理痛症状的最佳模型［9］，而足三里穴（ST36）是治疗坐骨神经痛的重要穴位［10-12］，故在本研究中被采用。研究结果表明，装载DXM 的CS/GP 水凝胶在ST36 处注射后可显著提高CCI 大鼠的PMWT，减少痛敏现象。

IL-1β 和TNF-α 是核转录因子-κB（NF-κB）信号通路中的重要因子，在炎症反应中首先表达，并在促进炎症发展中发挥重要作用［13］。本研究观察到CCI组大鼠血清中TNF-α、IL-1β 显著增加，而与CCI 组比较，CS/GP/DXM 组大鼠血清中TNF-α 与IL-1β 的表达明显降低，表明载有控释药物的CS/GP/DXM 水凝胶可以通过长时间刺激穴位起到抗炎镇痛的作用。此外，本研究通过观察脊髓背角上小胶质细胞及P2X4R 的表达量，进一步探索可注射CS/GP/DXM 水凝胶可能的镇痛机制。周围神经损伤后，脊髓背角小胶质细胞的激活及其表面P2X4R 的表达对痛觉的维持有重要作用［14-15］，阻断小胶质细胞中P2X4R 的表达可能是治疗神经病理性疼痛的新策略［16］。对于神经病理性疼痛的分子机制研究也发现，神经损伤后P2X4R会迅速在脊髓中大量表达［17］。本次研究结果表明，装载DXM 的CS/GP 水凝胶能够抑制CCI 大鼠脊髓背角上小胶质细胞的活化以及P2X4R 的表达，具有良好的镇痛效果。

总之，装载DXM 的CS/GP 水凝胶因其良好的生物相容性、可注射性、温敏性以及对药物的缓释作用，在对CCI 大鼠的穴位埋植治疗中具有一定的优势，可用作一种新型穴位埋植材料，在治疗神经性疼痛中具有很大前景。今后本团队还需对其在体内治疗的作用做进一步考察，以明确本疗法的临床应用前景。