滑膜肉瘤中P300与EMT相关蛋白的表达及临床意义

陈 浩，张 贞，王 宁，董双双，连小娟，梁伟华，蒋金芳，庞丽娟，齐 妍

滑膜肉瘤(synovial sarcoma, SS)是一种较少见的具有双相分化、高侵袭性的软组织肿瘤，约占软组织肉瘤的10%；特征是存在特异性t (X;18)(p11;q11)易位产生SYT(18q11.2)-SSX(Xp11.2)融合基因，是SS主要致瘤因素且在临床病理诊断中发挥重要作用。SS的组织形态学主要有BSS和MFSS两种类型，前者在梭形细胞背景下表现为腺体或巣团上皮样细胞，后者以梭形细胞为主[1]。课题组前期研究[2-3]表明，上皮间叶转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相关因子在SS的上皮和间叶成分中表达水平存在的差异，提示SS与EMT密切相关；通过外显子芯片方法在SS中的上皮和间叶成分筛选出差异基因23个，包括转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)通路下游基因P300。该文通过检测SS不同组织成分中P300及EMT相关蛋白的表达，探讨P300在滑膜肉瘤EMT中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例材料收集自1968-2015年石河子大学医学院第一附属医院病理科和新疆医科大学第一附属医院病理科SS石蜡包埋组织40例，根据WHO软组织最新分类标准(第五版)和Enzinger&Weiss软组织肿瘤进行分型和分类，病理组织学分级参照法国癌症中心联盟软组织肉瘤分级系统；TNM分期参照国际抗癌协会与美国癌症联合委员会制定的TNM分期系统。所有病例均进行免疫组化及一步法RT-PCR技术检测SYT-SSX融合基因检测进行最终确诊，其中包括双相型30例，单相纤维型10例。所有样本由资深病理医师复诊。40例SS患者中随访例数为25例，因联系方式或住址更换等原因导致15例失访，随访率为62.5%。

1.2 融合基因检测提取样本组织中的RNA(石蜡TRIzol法，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司)，用一步法RT-PCR(试剂盒来自QIAGEN公司)扩增融合基因SYT-SSXl和SYT-SSX2(引物由Sangon合成，引物序列及退火温度见表1)，经1.5%琼脂糖(BBI)凝胶电泳分析结果。

表1 PCR所用引物序列、引物对、退火温度及扩增片段大小

1.3 免疫组织化学及结果判读实验采用Envision二步法试剂盒(北京中杉公司)，设立空白、阳性及阴性对照。检测P300(1 ∶500，英国Abcam公司)及31例SS中E-cadherin(1 ∶200， 丹麦DAKO公司)，N-cadherin、β-catenin(1 ∶400)、Snail(1 ∶800)、Slug(1 ∶200)(英国Abcam公司)蛋白表达情况。判定染色结果采用统一评分标准，由两位高年资病理医师独立双盲阅片，结果取平均值。根据阳性细胞百分比和着色强度评分，结合阳性细胞及着色强度相乘分级，积分0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性()。

1.4 统计学处理应用SPSS 26.0分析软件，采用卡方检验或Fisher确切概率法对实验所得P300、SYT-SSX表达情况数据进行统计分析，分析P300与滑膜肉瘤临床与病理资料之间的关系以及P300与E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug的相关性。运用 Cox 回归模型对 SS 患者总生存时间进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P300表达与SS临床病理信息的相关性在40例SS中P300表达率为95%(38/40)。结果表明P300的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位、融合基因分型、组织学分级、TNM分期以及有无远处转移均无统计学意义(表2)。

表2 P300与滑膜肉瘤临床病理参数的关系

对所有患者进行随访，仅获得25例患者随访资料，随访时间约为3～69个月，中位随访时间为26个月，其中10例存活，15例死亡。通过 Cox 回归模型探讨SS患者临床病理参数对患者总生存时间的影响显示，肿瘤发生转移(P=0.019)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.003)是患者总生存时间的独立危险因素(表3)，而患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、融合基因分型以及组织学分级与患者生存时间没有明显相关性。

表3 SS患者生存时间多因素Cox回归分析

2.2 SYT-SSX融合基因与组织学分型的相关性40例SS患者中SYT-SSX融合基因阳性率为92.5%(37/40)，其中BSS和MFSS分别为90%(27/30)、100%(10/10)。用一步法RT-PCR分别检测SYT-SSXl型和SYT-SSX2型，扩增产物为118 bp (图1)。30例BSS中，SYT-SSX1型的阳性率为66.7%(18/27)，SYT-SSX2型为33.3%(9/27)；10例MFSS中，SYT-SSX1型为80%(8/10)，SYT-SSX2型为20%(2/10)。融合基因类型与SS组织学类型间的差异无统计学意义(P=0.688)，可能与样本数量较少有关。

图1 滑膜肉瘤SYT-SSX融合基因RT-PCR扩增产物(118bp)电泳图

2.3 P300在BSS及MFSS中的表达P300在肿瘤细胞呈胞核着色。BSS中P300表达率为93.3%(28/30)，强阳性率为33.3%(10/30)，在上皮样区表达明显高于梭形细胞区(图2A)。MFSS中P300表达率为100%(10/10)，强阳性率为60.0%(6/10)(图2B)。P300在MFSS中的表达阳性强度高于BSS，两者差异无统计学意义(P<0.05)。

图2 P300在滑膜肉瘤不同组织学亚型中的表达

2.4 P300与EMT相关蛋白在SS中表达的相关性

2.4.1P300与EMT相关蛋白在SS不同组织学类型中的表达 分析P300阳性表达与EMT相关分子表达的相关性(图3、表4)。在BSS中，P300的表达与EMT相关分子E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug的表达差异无统计学意义，与β-catenin的表达差异有统计学意义(P=0.027)，P300高表达的病例中，77.8%(7/9)β-catenin不表达，反之，P300低表达的病例中，76.9%(10/13)β-catenin阳性表达。

表4 SS中P300与EMT相关蛋白表达的关系[n(%)]

在MFSS中，P300的表达与E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Snail的表达差异无统计学意义，而与Slug的表达差异有统计学意义(P=0.048)，P300高表达的病例中，80%(4/5)Slug不表达，P300低表达的病例中，100%(4/4)Slug呈阳性表达。以上结果提示P300可能在SS的EMT过程中发挥一定作用。

图3 EMT相关蛋白在BSS和MFSS中的表达 EnVision ×200

2.4.2P300与EMT相关蛋白在BSS不同细胞成分中的表达 分析BSS的上皮样细胞成分和梭形细胞成分中P300与EMT的关系(表5)。在BSS上皮样细胞成分中，P300的高表达率为63.3%，其中E-cadherin、N-cadherin和β-catenin高表达，Snail和Slug低表达；而P300低表达的病例中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Slug和Snail均高表达，差异无统计学意义。在梭形细胞成分中，P300的高表达率为26.7%(8/30)。无论在P300高表达还是低表达的病例中，P300与EMT相关蛋白的表达差异均无统计学意义。

3 讨论

几乎所有的SS都具有特征性融合基因SYT-SSX，其不仅可以作为临床病理诊断有效的检测指标，而且在致瘤过程中具有重要作用[4]。SS的发生发展可能与EMT相关，且融合基因有一定的调控作用。Ladanyi et al[5]对243例SS病例分析发现，98%的患者表达SYT-SSX基因，其中61%为SYT-SSX1，37%为SYT-SSX2；BSS中SYT-SSX1的表达高于SYT-SSX2，MFSS中SYT-SSX1的表达低于SYT-SSX2，认为SYT-SSX1基因可能更容易促进肿瘤细胞上皮分化。Wei et al[6]对37例SS研究发现，SYT-SSX的表达率为89.2%，BSS均为SYT-SSX1型，MFSS均为SYT-SSX2型；表明SYT-SSX与SS的组织学分型可能有关。本研究中66.7%的BSS存在SYT-SSX1，33.3%为SYT-SSX2 ，1型明显高于2型，与文献报道相符合；但在MFSS中80.0%为SYT-SSX1，20.0%为SYT-SSX2，和文献报道略有差异，可能与样本量少有关。

表5 BSS不同细胞成分中P300与EMT相关蛋白的相关性[n(%)]

SYT-SSX可通过干扰Snail、Slug对E-cadherin的转录抑制作用，进而影响EMT过程[1]。EMT与间叶性肿瘤和肉瘤的生物学和临床过程相关，该过程中上皮细胞溶解细胞间连接，获得具有增强迁移能力的间充质特性，促进了肿瘤细胞的浸润和转移。EMT过程受转录因子、信号通路和miRNA等很多因素的影响，相关的信号通路有TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Src、Ras-MAPK等。TGF-β作为EMT发展中的一个重要的通路，在肿瘤的发展中发挥重要的促癌作用[7-8]。课题组前期通过分析BSS上皮和间叶两种细胞成分基因组SNP的改变，显示两种成分之间存在23个显著差异基因(包括P300)，而P300是TGF-β通路中的一个下游基因[3, 9]。P300在TGF-β信号通路中起到关键作用，它作为Smad3的转录辅活化因子，通过与Smad3的相互作用或介导组蛋白乙酰化促进了TGF-β通路的激活[10]。

P300是转录共激活因子组蛋白乙酰转移家族中的一员,参与多种细胞过程如增殖，分化，凋亡，细胞周期调控和DNA损伤应答的调节[11]。de Bruijn et al[12]研究发现，SS相关蛋白SS18(也称SYT或SSXT)作为转录共激活因子，其活性可能是由P300等因子介导的。Krubasik et al[13]研究发现，在结肠癌中P300的缺乏导致癌细胞的黏附性降低和迁徙能力增加，暗示P300的缺乏可能促进EMT过程。在乳腺癌中的研究中[14]，P300的高表达与病理组织分型、临床分期和复发转移呈正相关，缩短了患者的生存期及无疾病进展生存期，提示P300的表达是预测和评估乳腺癌预后的重要独立因素。P300在肉瘤方面的研究甚少，主要涉及P300作为肉瘤癌蛋白的转录辅活化因子[12]，但关于滑膜肉瘤临床预后及EMT方面的研究甚少。本研究表明，BSS中P300的表达与E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug的表达均无关，但其表达强度与β-catenin密切相关；而在MFSS中P300的表达强度与Slug密切相关。在肿瘤中，Smad依赖性TGF-β通路能够诱导Snail、Slug等因子的表达，Wnt/β-catenin通路会使细胞质和细胞核中的β-catenin过度表达，从而导致EMT的发生以及肿瘤的转移[8]，以上提示P300可能参与SS的上皮样细胞分化以及EMT过程，具体机制尚待进一步深入研究。

综上所述，P300作为TGF-β信号通路的下游基因可能参与SS上皮分化及EMT过程，在其发生发展中发挥重要作用，从而影响SS的侵袭转移。