维生素D受体基因多态性与急性胰腺炎临床转归的关联研究

刘 瑜，严妤函，黄 方，郭 蕾，陈阳希，杨 晨，张兴虎，万文辉

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床上常见的急危重症。重症者因释放大量炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白细胞介素(interleukin, IL)-6，产生全身炎症反应，导致多器官功能障碍或衰竭，病死率高[1]。维生素D(vitamin D，VD)是人体中一种重要的脂溶性维生素，具有重要的炎症和免疫调节作用[2]。活化的VD[1,25(OH)2D]通过与细胞内的维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合从而调控靶基因的转录和表达。

研究表明，AP的严重程度由环境和遗传因素共同决定。VDR基因的遗传变异可能通过影响VDR的表达和功能对循环中VD浓度平衡以及整个机体最终代谢产物的活性产生重要影响，包括影响活性VD对炎症反应的调节能力，从而导致个体间基因型依赖的AP不同预后[3]。因此，该研究在汉族AP人群中，探讨VDR基因多态性与AP临床预后的相关性，为早期识别危重患者提供遗传学依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料选取2018年1月至2019年12月原南京军区南京总医院消化内科和普通外科ICU收治的AP患者508例。AP的诊断需符合以下3项中的2项[4]：①急性、持续、严重的上腹部疼痛；②血清脂肪酶(或淀粉酶)活性至少大于正常值上限3倍；③影像学检查(通常采用增强CT)有AP的特征性表现。纳入标准：年龄≥18岁、汉族、AP诊断明确、病历资料齐全。排除标准：①无法获得知情同意书；②具有其他特殊疾病，如获得性免疫缺陷综合征、自身免疫性疾病，器官移植后，心、肝、肾、肺、脑等重要器官功能衰竭终末期；③曾摄入或应用过对炎症过程有调节作用的细胞因子，如TNF-α抗体等；④接受免疫抑制剂和激素治疗。所有受试者均签署知情同意书，本研究经原南京军区南京总医院伦理委员会审核通过。

1.2 临床资料采集采用调查表的形式，收集AP患者的社会人口学资料、既往病史、吸烟饮酒史、发生AP的原因、实验室和辅助检查结果，计算体质量指数(body mass index, BMI)、诊断AP后最高急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation, APACHE)Ⅱ、序贯器官衰竭(sequential organ failure score，SOFA)评分、临床转归。所有入选患者抽取静脉血3 ml，枸橼酸钠抗凝，-20 ℃保存备用。基于局部因素和全身因素对急性胰腺炎严重程度进行分级[5]：①轻型AP：不存在胰腺(胰周)坏死以及器官功能衰竭。②中型AP：存在无菌性胰腺(胰周)坏死和(或)暂时性的器官功能衰竭。③重型AP：存在感染性胰腺(胰周)坏死或者持续性的器官功能衰竭。④危重型AP：感染性胰腺(胰周)坏死合并持续性器官功能衰竭。依据临床转归，将AP患者分为脓毒症/非脓毒症组、重症(重型+危重型)/非重症(轻型+中型)组、住院期间死亡/存活组。

1.3 主要方法

1.3.1SNP位点的选择 ① 利用haploview软件检索VDR基因中的标签SNPs；② PubMed检索文献，查找hot SNPs； ③ 优先考虑功能位置(外显子、5′UTR及3′UTR)。最终选择了14个位点进行研究(表1)。

表1 VDR基因多态性位点信息

1.3.2基因组DNA的提取和基因分型 采用TGuide Blood genomoic DNA试剂盒提取基因组DNA并行琼脂糖凝胶电泳进行质控和定量。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的连接酶检测反应(improved ligase detection reaction, imLDR)技术。所有SNP位点的基因分型成功率均大于95%。分型结束后，随机选择50份样品进行重复检测，一致性率为100%。

1.4 统计学处理使用SPSS 19.0软件包进行统计学分析。计数每个SNP位点的基因型频率，进行goodness-of-fit χ2检验，判断是否符合Hardy-Weinberg平衡。组间连续变量的差异采用独立样本的t检验，非正态分布者采用非参数检验，分类变量采用χ2检验。利用Haploview软件进行连锁不平衡分析，构建单倍型。非条件Logistic回归模型校正年龄、性别、BMI、吸烟饮酒状态、慢性病状态、APACHE II评分等，在不同的遗传模式下分析各位点基因型频率和单倍型频率与AP患者不同临床转归的相关性，计算P值、比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(confidential interval，CI)。所有统计均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料共纳入AP患者508例(表2)，男性343例(67.52%)，女性165例(32.48%)，年龄18～86(44.81±13.80)岁。胆源性胰腺炎是最常见的类型，占49.80%，其次是高脂血症型(43.70%)，乙醇性(1.57%)，其他类型胰腺炎相对少见。中位住院天数为14(9～35)d，住ICU 天数3.5(0～18)d，期间发生脓毒症158例(31.10%)，重症AP 211例(41.54%)，死亡47例(9.25%)。所有患者均按照急性胰腺炎诊治指南给予治疗(表2)。

表2 508例胰腺炎患者临床资料

2.2 VDR基因多态性与AP患者临床转归的相关性所有位点的频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(表1), 说明该研究位点选择的样本具有群体代表性。脓毒症者与非脓毒症者在年龄、性别、吸烟饮酒状态、BMI上无明显差异，脓毒症者具有较高的APACHE II评分、SOFA评分，较长的住院和住ICU时间和较高的死亡率(表3)。非条件Logistic回归分析显示，rs12721375(G→A)GA/AA基因型较GG发生脓毒症的风险低[OR(95%CI)=0.25(0.08～0.79)，P=0.02]；A等位基因型发生脓毒症的风险较G低[2.16 (1.12～4.19)，P=0.009]。rs2853559(A→G)GA较GG发生脓毒症风险高[0.23 (0.08～0.7)，P=0.022]，GA/AA较GG脓毒症风险升高[2.03(1.09～3.79)，P=0.026](表4)。

表3 AP患者不同预后组间临床特征比较

表4 VDR基因多态性与AP患者发生脓毒症的相关性[n(%)]

重症AP患者与非重症相比，在年龄、性别、吸烟饮酒状态上无明显差异，重症者具有较高BMI和APACHE II评分、SOFA评分，较长的住院和住ICU时间和较高的死亡率。非条件Logistic回归分析显示，rs11168287(G→A)AA基因型较GG或GG/GA发生重症AP风险高[4.17(1.15～15.16)，P=0.030、4.11(1.23～13.70)，P=0.022]；rs2853559(A→G)AA基因型较GG或GG/GA发生重症AP风险高[4.61(1.24～17.08)，P=0.022、4.417(1.253～15.58)，P=0.021](表5)。

AP死亡患者较存活患者年龄、性别、吸烟饮酒状态、BMI无明显差异，死亡者具有更高的APACHE II评分、SOFA评分，较长的住院和住ICU时间，较高的死亡率和较高的COPD发生率。非条件Logistic回归分析显示，rs11168283(C→T)CT/TT基因型较CC型发生死亡风险低[0.45(0.20～0.99)，P=0.046](表6)。

3 讨论

AP尤其是重症AP是临床常见的急危重症，在世界范围内其发病率呈上升趋势，且死亡率高。爆发性的促炎细胞因子释放引起全身炎症反应综合征，可导致胰外重要器官功能障碍或衰竭而死亡，重症AP的死亡率可高达30%以上[1]。研究表明，VD通过自分泌或旁分泌方式对天然和获得性免疫发挥调节作用。VD通过活化VDR能促使单核细胞分化为成熟巨噬细胞、上调抗菌肽的表达、诱导树突状细胞和T淋巴细胞的免疫耐受、抑制辅助性T细胞1(T helper cells 1, Th1)向Th2转化、抑制活化B细胞向浆细胞及记忆性B细胞的分化及免疫球蛋白的产生[2]。既往研究[3,6]表明AP患者普遍存在VD缺乏，且缺乏程度与预后呈正相关。AP的发生和转归受遗传、代谢和环境因素的共同影响，本文首次在中国汉族人群中，对AP患者VDR基因多态性进行检测并探讨VDR基因多态性与AP患者预后的相关性。

表5 VDR基因多态性与AP患者发生重症的相关性[n(%)]

表6 VDR基因多态性与AP患者死亡的风险[n(%)]

本研究纳入AP患者508例，男性多于女性，胆源性AP是最常见的AP类型(49.80%)，其次是高脂血症型(43.70%)，与国内报道相符，而国外主要以胆源性和乙醇性AP为主。随着国人生活水平的提高，高脂血症的发病率逐年增加，其中以高甘油三酯血症为主，而高甘油三酯是AP的重要病因[7]。508例AP患者中211例(41.53%)进展为重症，本研究同时从消化内科和普通外科ICU选择患者，普通外科ICU收治的大多数都是重症AP，故本研究重症患者比例较大。死亡47例(22.27%)，均为重症患者。研究选择了VDR基因上14个SNPs位点进行研究，最大程度代表了VDR基因上常见的遗传信息。共有4个SNPs位点与脓毒症预后相关，均位于内含子区。rs12721375 GA/AA基因型和A等位基因发生脓毒症的风险较低(P均<0.05)。rs2853559 GA和GA/AA基因型具有较高的脓毒症发生风险(P均<0.05)；rs11168287 和rs2853559 AA基因型发生重症AP的风险较高(P均<0.05)；rs11168283 CT/TT基因型发生死亡风险较低(P=0.046)。目前对这4个SNPs位点的研究较少，Baca et al[8]、Mutti et al[9]分别发现VDR rs2853559与妊娠妇女体内25-羟维生素D水平或近视相关。Hu et al[10]、Orlow et al[11]分别发现VDR rs11168287 A等位基因型或AA基因型能增加肺结核或黑色素瘤发病风险；Engel et al[12]研究发现AA基因型能降低乳腺癌发病风险。rs12721375、 rs11168283则鲜有文献报道。虽然内含子处于非编码区，但基因间区SNPs可以通过影响RNA剪接间接影响蛋白质合成。此外，内含子也有自己的转录单位，能产生调控RNA或小蛋白，从而影响基因的表达[13]。本研究中4个阳性位点影响AP的机制还需进一步研究。

本研究首次在中国汉族人群中发现VDR基因遗传多态性与AP预后有关。由于AP患者均来自于医院，研究本身存在选择偏倚。同时，本研究样本量较少，统计效力不够，所选择的位点并不能代表VDR基因中所有的遗传变异信息，不排除该基因中还有其他位点与AP相关。下一步还有必要开展重复性、多中心、大样本研究对这一结果进行验证。