LncRNA SIL对肺泡上皮细胞增殖和迁移的抑制作用研究

张万方，潘鹏涛，何金娇，朱艳平，王选年

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是以肺部蜂窝状结构改变引起限制性通气障碍为主要特征的一种间质性肺部疾病。大量研究证明lncRNA与肺纤维化有重要的关系，例如，lncRNA PFAR[1]，lncRNA ZEB1-AS1[2]，lncRNA ITPF[3]，lncRNA PFRL[4]以及lncRNA PFAL[5]等参与了肺纤维的发生过程。转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β1)是诱导肺泡上皮细胞间质转化的关键因子[6]。使用TGF-β1诱导后，肺泡上皮细胞标志蛋白E-Cadherin(E.cad)的表达量降低，间质细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Collagen-1的表达量升高[7]。LncRNA SIL是突触极蛋白2(SYNPO2)第四个内含子[8]，前期研究显示lncRNA SIL在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中表达降低，推测lncRNA SIL可能是肺纤维化的潜在抑制因子。该文研究了lncRNA SIL在TGF-β1诱导肺泡上皮细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的表达变化，并构建了lncRNA SIL真核表达载体，通过研究过表达lncRNA SIL后肺泡上皮细胞生长特性以及标志蛋白表达的变化，分析lncRNA SIL在肺纤维化发生过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料肺泡上皮细胞株(A549)购自上海生物科学研究所；鼠抗人抗体PCNA、E.cad 、α-SMA和Collagen-1购自美国Abcam公司；鼠抗人抗体GAPDH 购自美国Santa Cruz公司；羊抗鼠二抗购自美国Abcam公司。荧光显微镜80i购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1RNA 荧光原位杂交(RNA fish) 细胞RNA fish采用广州博锐生物科技有限公司 lncRNA FISH 试剂盒，按照说明书的要求进行原位杂交实验。具体步骤如下：细胞通过4%的多聚甲醛室温固定10 min，每孔加入1 ml 预冷的0.5% Triton X-100 的PBS，4 °C静置 5 min；加入1× PBS清洗细胞 3次，每次5 min，加入RNA探针37 °C孵育过夜，避光42 ℃，SSC缓冲液清洗细胞3次，每次5 min，清洗、避光，加入DAPI 染色液，室温染色10 min, 使用荧光显微镜观察并拍照记录(80i, 日本Nikon公司)。

1.2.2转染 合成的全长lncRNA SIL连接在pCMV-sport6载体上，使用Lipo3000将lncRNA SIL重组质粒转染到A549细胞中，pCMV-sport6空载体做为阴性对照，在转染后4～6 h更换完全培养液，同时加入TGF-β1(5 μmol/L)诱导，分别在诱导24、48 h收材作进一步检测。

1.2.3RT-PCR 收集处理后的A549细胞，加入TRIzol消化，提取RNA。使用Nanodrop 2000检测RNA的纯度和浓度，并逆转录成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，加入引物、2×qPCR MasterMix (SYBR Green)和ddH2O，混匀后放入荧光定量PCR仪中，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，40个循环。根据公式2-△△Ct，以GADPH为内参进行定量分析。RT-PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.2.4细胞划痕实验 收集细胞、计数并以5×105个/L的密度铺板，待细胞密度达到70%时转染，24 h后使用无菌20 μl枪头划线，随后PBS洗细胞3次，加入0.5%血清的DMEM培养基培养，分别于0、24、48 h采集细胞迁移图像，观察细胞伤口愈合情况并计算细胞的迁移率[9]。

1.2.5Western blot 取处理后的细胞，裂解细胞提取总蛋白。SDS-PAGE电泳后，转膜，室温封闭1～2 h，加入一抗 PCNA (1 ∶1 000)，E.cad (1 ∶1 000)，α-SMA (1 ∶1 000)，Collagen-1 (1 ∶500)，GAPDH (1 ∶5 000)，4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记的二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1 h。加入ECL试剂进行显色。

1.2.6免疫荧光实验 在24孔板中放入盖玻片，接种A549细胞，待细胞长到70%～80%时转染，48 h后，使用4%多聚甲醛固定细胞5 min，PBST洗涤3次，每次5 min，加入含有1% BSA的封闭液室温封闭1 h，加入PBST清洗3次，每次5 min，加入一抗(1 ∶200)，4 ℃封闭过夜，避光条件下加入Cy3标记的二抗(1 ∶500)，室温孵育1 h，加入PBST洗涤3次，每次5 min。避光加入DAPI室温孵育10 min，固定到载玻片上，于荧光焦显微镜下观察拍摄照片[10]。

2 结果

2.1 lncRNA SIL在TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞间质转化中表达降低在培养的肺泡上皮细胞A549中加入TGF-β1诱导EMT，并分别通过RNA fish与RT-PCR检测lncRNA SIL的表达情况。结果显示，TGF-β1诱导48 h后细胞中的lncRNA SIL的表达量与阴性对照组和转染lncRNA对照组相比荧光强度和数量均降低(图1A)。RT-PCR检测TGF-β1诱导24 h和48 h后lncRNA SIL的表达情况，结果显示，lncRNA SIL的表达量随着TGF-β1的诱导时间的延长逐步降低，方差分析显示，3组之间lncRNA SIL的表达量差异有统计学意义(F=298.8,P<0.01)，诱导24 h细胞lncRNA SIL的表达量低于未诱导组(F=14.4,P<0.05)，诱导48 h细胞lncRNA SIL的表达量低于与诱导24 h(F=10.25,P<0.01)(图1B)。

2.2 过表达lncRNA SIL抑制肺泡上皮细胞A549迁移lncRNA SIL基因序列全长为1 914 nt，由上海生工生物工程有限公司合成，构建重组真核表达载体pCMV-lncRNA SIL。将构建的重组质粒pCMV-lncRNA SIL转染到肺泡上皮细胞A549中，其中空载体pCMV为阴性对照。结果显示，与空载体pCMV对照组相比，转染lncRNA SIL后细胞的迁移能力降低，见图2。

2.3 过表达lncRNA SIL抑制肺泡上皮细胞A549增殖lncRNA SIL对A549细胞增殖方面作用的研究结果显示：转染后，过表达lncRNA SIL组细胞的增殖能力低于对照组；细胞增殖相关蛋白PCNA和Ki67表达变化的研究显示，过表达lncRNA SIL后，PCNA的表达量与对照组相比降低；Ki67 mRNA表达水平也比对照组降低，免疫荧光结果图中可以看出过表达lncRNA SIL组细胞Ki67蛋白的荧光信号比对照组减少，见图3。

2.4 过表达lncRNA SIL抑制间质细胞标志蛋白的表达lncRNA SIL在TGF-β1诱导的EMT过程中对相关细胞标志蛋白表达变化的研究结果显示。当使用TGF-β1对细胞进行诱导时，标志蛋白α-SMA和Collagen-1的表达量比未诱导组升高。当TGF-β1诱导并同时转染lncRNA SIL后，标志蛋白α-SMA和Collagen-1的表达量与转染空载体pCMV相比降低，标志蛋白E.cad的表达量与转染空载体pCMV相比升高。由此说明lncRNA SIL能够抑制TGF-β1诱导的EMT，也揭示出lncRNA SIL很有可能通过抑制EMT最终达到抑制肺纤维化的目的。

图1 LncRNA SIL在TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞A549间质转化中表达降低 ×400

图2 过表达lncRNA SIL抑制肺泡上皮细胞A549迁移 ×40与空载体pCMV组比较：**P<0.01

3 讨论

LPF是一种慢性、进行性、不可逆性的肺间质组织异质性疾病，随着年龄增长显著增加，男性发病率更高，发病机制不清楚，致残率、病死率高，诊断后的平均生存期仅为2～5年[11]。因此研究肺纤维化的发病机制对临床诊断和治疗具有重要的意义。

LncRNA通常指一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本，虽然lncRNA不具有编码蛋白的功能，越来越多的研究[12]发现，lncRNA与细胞生长、增殖、迁移、侵袭以及药物耐性等多种重要生命过程有重要的关系。近年有研究[13]发现一些lncRNA参与到了肺纤维化发生的调控中，例如lncRNA DNM3OS在TGF-β诱导的肺肌细胞激活中发挥重要作用；lncRNA sirt1 AS能够抑制TGF-β1介导的EMT[4]；lncRNA H19在IPF患者以及博来霉素处理小鼠的肺组织中表达上调，缺失lncRNA H19可改善博莱霉素诱导的肺纤维化[14]等。LncRNA SIL是近年来新发现的lncRNA，本实验的前期研究结果显示lncRNA SIL在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中表达降低，因此推测其可能参与了肺纤维化的调控。本文为研究lncRNA SIL对TGF-β1诱导的EMT过程的影响，首先利用TGF-β1诱导A549细胞进行上皮间质转化，并检测诱导后lncRNA SIL的表达量的变化。结果显示，TGF-β1诱导后细胞中lncRNA SIL表达量低于对照组，此结果与前期动物模型中的结果一致。为了进一步证明lncRNA SIL的作用，构建了lncRNA SIL真核表达载体，通过向A549细胞中转染lncRNA SIL，分析过表达lncRNA SIL后对细胞的增殖与迁移能力的影响。结果显示，过表达lncRNA SIL后细胞的增殖与迁移能力均比对照组降低；对相关标志蛋白的研究结果从另一方面证明了lncRNA SIL的作用，结果显示，过表达lncRNA SIL后，与对照组相比间质细胞标志蛋白α-SMA和Collagen-1的表达降低，而肺泡上皮细胞标志蛋白E.cad的表达升高。以上结果证明lncRNA SIL很可能是一种肺纤维化的抑制因子，其通过抑制肺泡上皮细胞的增殖、迁移和转化最终达到抑制肺纤维化的目的。

图3 过表达lncRNA SIL对A549细胞增殖能力的影响

图4 过表达lncRNA SIL对抑制间质细胞标志蛋白的表达与空载体组比较：*P<0.05