一种通过水光谱探究木犀草素浓度测定的新方法

冯昱龙，贺小刚，韩 想，于佳萍，楚刚辉

（新疆特色药食用植物资源化学实验室 喀什大学 化学与环境科学学院，新疆 喀什 844000）

木犀草素（Luteolin）是一种常见的天然黄酮类化合物，存在于多种植物中，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，富含木犀草素的药物常用于治疗心脑血管等疾病［1］。目前，木犀草素的常见检测方法有高效液相色谱法（HPLC）［2］、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）［3］、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）［4］、毛细管电泳-二极管阵列检测法（PCE-DAD）［5］等。这些方法虽具有很好的选择性，但存在分析速度慢、操作较繁琐、分析成本高、需使用有毒溶剂等缺陷［6］。

“水光谱组学（Aquaphotomics）”由日本学者Tsenkova 在2005 年首次提出［7］。水光谱组学以水为研究对象，分析生命体系的水和各种频率下近红外光的相互作用，由于水的OH 键很容易被其他分子改变，因此可以通过检测水分子体系本身的溶质变化进行研究［8］。水的溶剂化作用和团簇构造的改变对其结构影响很大，水的近红外光谱（NIR）中包含了大量的溶质信息［9］。不同种类和浓度的溶质对水溶剂的影响不同，低浓度溶质也会导致水分子结构的变化，因此，近红外光谱的某些范围频谱可以放大溶质的信息，甚至可以测量非常低的溶质浓度。近红外光谱法不需要衍生化或其他繁琐费时的样品制备过程，检测不破坏样品，具有较大的优势。

水光谱组学的应用十分广泛，由于活性成分对水结构的影响可以改变近红外光谱中水的光谱信息，将溶液中除水之外的物质当作扰动因素（如浓度、温度等）分析光谱中的谱峰变化，可以探究待测物质的特性。赵洪涛等［10］将水光谱组学用于探究低温水的结构；Chatani等［11］利用实时NIR 光谱和水光谱组学对胰岛素的淀粉样沉淀过程进行了研究；Czarnecki等［12］研究了温度对N-甲基乙酰胺水溶液结构的影响。同时，近红外光谱结合水光谱组学己成功用于测定低含量的蛋白［13］、糖［14］、盐和酸［15］等。但这种方法在活性成分研究上并不多见，利用水光谱进行低含量木犀草素的测定也未见相关报道。

物质在近红外谱区的倍频和合频吸收信号弱，谱带重叠，解析复杂，而偏最小二乘法（PLS）有较强的信息提取能力，能够有效降维，并消除自变量间可能存在的复共线关系，明显改善数据结果的可靠性和准确度［16］，是近红外谱最好的研究方法。

本文基于扰动因素对水光谱的影响，采用Kennard-Stone（KS）法进行校正集和验证集的划分筛选，通过近红外光谱方法对低浓度的木犀草素进行定量分析，为水环境下准确测定木犀草素浓度提供了一种新的可能性和方便高效的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

AntarisⅡ近红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SME204E 电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；木犀草素（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、无水乙醇（色谱纯，天津光复科技发展有限公司）。

1.2 实验方法

称取20 mg 木犀草素标准品，加无水乙醇定容至200 mL，得到100 mg/L 的木犀草素乙醇溶液。将配制好的木犀草素乙醇溶液、超纯水、无水乙醇置于25 ℃恒温水浴锅中待测。取木犀草素乙醇溶液，分别加入不同体积（0.1、0.3、0.5 mL）的水，用乙醇定容，并使溶液总体积为2 mL，配制3 组样品，即各组中水的体积分别为0.1、0.3、0.5 mL，每组30 个，各组的木犀草素质量浓度范围均为50～80 mg/L（0.17～0.27 mmol/L），梯度为1 mg/L。

1.3 光谱测量

将AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪于室温下预热1 h，选择透射模块采集样品光谱，测量90 个样本的近红外光谱，扫描波数范围为4 000～10 000 cm−1，仪器分辨率为4 cm-1，测量时仪器每隔1 h自行进行背景校正。每个样品的近红外光谱均经过64 次扫描，重复3 次，将3 次测量的结果取平均值作为样品的最终光谱数值。为提高近红外光谱的灵敏度，结合化学计量学，采用PLS方法构建模型。

1.4 样本筛选

KS 法［17］是将所有样本均看作校正集的候选样本，首先选择欧氏距离或马氏距离最远的两个样本对进入校正集，计算剩余候选样本中的样本到校正集中每个已选样本的距离，找出最小距离值样本和最大距离值样本，加入到校正集中，重复此步骤，直至校正集样本数目满足要求。在建立近红外定量模型的过程中，KS法基于各个样本的近红外光谱数据计算两样本间的距离，即dx（p，q）是基于近红外光谱数据x计算p、q两样本间的距离，其计算公式见式（1）。由此选出的校正样本能够均匀地覆盖整个样本集实验区域，所建模型的预测能力较好。

1.5 定量模型的建立

利用KS法进行样品校正集和验证集的划分，随后筛选最佳的光谱预处理方法，以提高模型的准确性和有效性。在此基础上，探讨利用木犀草素对水光谱的扰动变化测定低浓度木犀草素的可行性，建立用于木犀草素浓度测定的PLS定量模型。

2 结果与讨论

2.1 木犀草素对水近红外吸收光谱的扰动

由于木犀草素在水中的溶解度较小，易溶于乙醇，首先考察了不同含量（0～100%乙醇，以10%递增）乙醇-水溶液的光谱，见图1A。对“1.2”方法配制的含0.5 mL 水的木犀草素溶液进行近红外光谱扫描，选择浓度间隔相等的样品做图，得到图1B。从图1A 可以看出，随着乙醇含量的增加，位于6 900 cm−1和5 170 cm-1处的2 个吸收峰的强度逐渐减弱，这主要归因于体系中水量的减少和氢键网络的改变。上述2 个谱峰分别归属为OH 基团伸缩振动的一级倍频和OH 基团弯曲及伸缩振动的组合频。由于水结构的复杂性，6 900 cm−1处的宽峰中包含了各种不同结构OH 基团的光谱信息，导致谱峰表现为很宽的重叠峰［18］，各峰的峰值由于差距较小，且与5 170 cm−1处的吸收相比灵敏度较低，线性关系可能较差。从图1A 还可以看出，5 170 cm-1处吸收峰的峰高随着水量的增加而增加，最高峰为纯水峰，最低峰为乙醇峰，说明此处的峰受含水量影响大，因此，在后续分析中主要研究了5 170 cm−1附近区域光谱的谱峰变化。对于图1B 中5 170 cm−1附近区域的光谱，因溶液中木犀草素的浓度较低，30个样品的光谱图很难用肉眼区分。由图1C可见，随着木犀草素质量浓度的增加，5 170 cm−1附近的光谱峰逐渐下降，这可能是因为木犀草素与水之间存在相互作用并导致水结构发生变化。

图1 不同含量乙醇-水溶液（A）和0.5 mL木犀草素水溶液在25 ℃（B）的近红外吸收光谱及后者在4 800～5 500 cm-1处的放大图像（0.17～0.27 mmol/L）（C）Fig.1 Near infrared absorption spectra of different contents ethanol-water solutions（A），0.5 mL luteolin solution at 25 ℃（B）and its’enlarged images ranging from 4 800 cm-1 to 5 500 cm-1（0.17-0.27 mmol/L）（C）

2.2 不同含水量木犀草素溶液的近红外吸收光谱

为考察不同含水量木犀草素溶液的浓度与水光谱峰变化之间的关系，采集“1.2”配制的含水量分别为0.5、0.3、0.1 mL 的木犀草素溶液在25 ℃时的近红外吸收光谱，其在5 170 cm-1附近的放大图如图2插图所示。结果显示，在不同含水量木犀草素溶液中，随着木犀草素浓度的增加，5 170 cm-1处的峰高均逐渐下降。

图2 不同浓度木犀草素溶液在25 ℃时的近红外吸收光谱Fig.2 Near infrared absorption spectra of different concentrations luteolin solutions at 25 ℃the illustrations are enlarged images；water volume（A-C）：0.5，0.3，0.1 mL

2.3 光谱预处理方法

由于不同浓度样品的光谱差异性很小，为了考察不同含水量木犀草素溶液的浓度与水光谱峰变化之间的关系，需采用化学计量学方法放大光谱差异。由

图3 0.3 mL木犀草素溶液的近红外吸收光谱差谱图Fig.3 Difference spectrum of near infrared absorption spectrum of 0.3 mL luteolin solution

图4 0.3 mL含水量下不同浓度木犀草素吸光度差异的雷达图Fig.4 Radar diagram of absorbance differences of luteolin at different concentrations in 0.3 mL water

2.4 不同浓度木犀草素水光谱定量校正模型的建立

以PLS 建立木犀草素溶液的定量校正模型，将90 个 样 品 光 谱 经 过 无 处 理、 一 阶 导 数（1st）、Savitzky-Golay 平滑（SG）、连续小波变换（CWT）、多元散射校正（MSC）、标准正态变换（SNV）、MSC+CWT、SNV+1st 等光谱预处理［21-23］，再通过蒙特卡洛交叉验证（MCCV）法［24］确定模型的因子数（Component number），选择波数范围为4 450～5 800 cm-1。经KS变量优选获得最优校正集，并获得更佳的定量模型，KS-PLS由Matlab R2014软件实现。

由于所得近红外光谱中既包含木犀草素的光谱信息，也包含其他杂质信息，因此本研究采用合适的光谱预处理方法提取特征信息后再进行分析。表1 为各种光谱预处理后得到的木犀草素定量模型的预测能力，以交叉验证均方根误差（RMSECV）、相关系数R值和预测残差值（RPD）作为评价模型的指标，其中，RMSECV 值反映了校正模型结果的误差，一般RMSECV 值越小定量结果准确度越好。RPD值反映了定量模型的预测能力，一般RPD 值越大定量结果越好［25］。由表1 可知，光谱预处理后，木犀草素样品的变量数均为1 557个，主因子数最大为9；其中CWT的RMSECV 误差最小，SNV的R和RPD值最大。综合来看，SNV 预处理的数据较好，能够达到定量分析的要求。此时定量模型的RMSECV 为1.947 8，RPD为4.292 7，说明模型稳健，误差小。

表1 经过KS处理的木犀草素PLS 模型的结果Table 1 Results of luteolin PLS model with KS treatment

2.5 不同浓度木犀草素水光谱模型的验证

预测均方根误差（RMSEP）反映了预测模型的误差，RMSEP 值越小表示预测结果越准确。使用6个外部预测集样品检验所建木犀草素定量校正模型的预测能力，预测集的实验条件与校正集基本相同。采用SNV 光谱预处理后进行验证，并建立了预测浓度与参考浓度之间的关系图（图5），得到预测的R为0.994 7，RMSEP 为2.077 7，预测集的样本回收率为98.0%～105%。结果表明，所建光谱模型的定量预测效果较好，能够更准确地进行木犀草素含量的测定。

图5 木犀草素参考浓度和预测浓度的相关关系Fig.5 Correlation between reference and predicted concentration of luteolin

3 结 论

本文以木犀草素为对象，基于近红外光谱快速、无损的优势，通过研究木犀草素对水近红外吸收光谱的扰动，建立了一种水溶液中木犀草素浓度的快速检测方法。采用差谱技术使光谱差距可视化，并比较了不同光谱预处理方法的效果，最终确定采用标准正态变换法进行光谱预处理，通过PLS法建立定量校正模型，模型的相关系数R为0.994 7，RMSECV为1.947 8，RPD为4.292 7。用该模型预测6 个外部样品组成的预测集，其RMSEP 为2.077 7，回收率为98.0%～105%。结果证明近红外光谱技术结合水光谱组学为低浓度木犀草素的测定提供了新的方法，为水中其他活性成分的测定提供了一种新的思路。