超高效液相色谱-串联质谱检测干血斑中29种β2-受体激动剂

赵 鹏，常 靖，吴小军，董林沛，刘冰洁，张云峰*

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.爱博才思亚太应用支持中心，北京 100015）

β2-受体激动剂可选择性作用于呼吸道平滑肌的β2受体，使支气管扩张和增加肺通气量，在临床医学上用于治疗支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病等。由于β2-受体激动剂在动物体内能促进脂肪分解，增加机体的蛋白质合成，增强骨骼肌收缩力，常被运动员滥用于减肥健美，或被禽畜生产企业非法添加在动物饲料中［1-3］。长期摄入此类药物会危害人体健康，小剂量也会引起急性中毒，引发头痛、胸闷、心悸、呼吸急促、恶心、呕吐和肌肉震颤等中毒症状［4-5］，并可诱发和加重心脑血管系统患者的病情，甚至导致死亡。目前已有大量β2-受体激动剂中毒或死亡的相关案例被报道［4-8］，而β2-受体激动剂的检测集中在畜产品的可食性组织和药物的非法添加方面［9-12］，在法庭毒物分析领域的报道相对较少［13］。因此，为满足毒物分析检验的应用需求，亟需建立中毒血液中β2-受体激动剂的检测方法。

干血斑（Dried blood spots，DBS）是一种简单易行的血液采集和储藏方法，最初被用于大批新生儿苯丙酮尿症的诊断和治疗［14］。DBS以棉纤维构成的采血卡为吸附载体，通过纤维素孔隙吸附基质和目标物，具有采样量小、易于储存和运输的特点，在常温条件下具有较高的稳定性［15-16］，可保存数天甚至数月。近年来，DBS技术被逐步应用于药物代谢和毒物分析，已有大量滥用药物和精神活性成分的DBS检测方法被报道［17-20］。本研究以DBS为样本保存载体，建立了全血中29种β2-受体激动剂的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法具有样品量小、保存方便和基质干扰小的特点，可用于法庭毒物分析领域。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；QTRAP 5500 三重四极杆串联质谱仪（美国AB Sciex公司）配有电喷雾离子源（ESI）；CM-1000振荡器（日本Eyela公司）；Biofuge Primo R 高速离心机（美国Thermo公司）。

甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲酸（HCOOH）、甲酸铵（色谱级，美国Fisher Scientific 公司）；29 种β2-受体激动剂标准品（见表1，天津阿尔塔公司，质量浓度均为100 μg/mL），用甲醇稀释并配制成质量浓度为1 μg/mL的混合储备溶液，于-20 ℃下储存；Whatman 903采血卡（英国Whatman公司）。

1.2 样品前处理

干血斑提取：吸取100 μL 全血滴在Whatman 903 采血卡上（半径约1 cm），室温下干燥2 h 后，待测。取整个血斑，绞碎后置于离心管中，加入1 mL甲醇，旋涡振荡10 min，8 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm有机滤膜后待测。

全血提取：吸取100 μL全血于离心管中，加入0.9 mL乙腈，其余操作同上。

1.3 色谱条件

Phenomenex Kinetex F5（3.0 mm×100 mm，2.6 μm）色谱柱；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；流动相：A 为1 mmol/L 甲酸铵-0.01%甲酸水溶液，B 为乙腈；进样体积为2 μL。梯度程序：0～1 min，5% B；1～1.1 min，5%～20% B；1.1～6 min，20%～95% B；6～8 min，95% B；8～8.1 min，95%～5%B；8.1～11 min，5%B。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；离子源温度：550 ℃；喷雾电压：5 500 V；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；29种β2-受体激动剂的质谱参数见表1。

表1 29种β2-受体激动剂的保留时间、质谱参数、线性范围、相关系数和检出限Table 1 Retention times（RT），MS parameters，linear ranges，correlation coefficients（r2）and detection limits（LOD）for 29 β2-agonists

1.5 血斑稳定性实验

将100 ng·mL-1的全血和干血斑加标样品置于-20 ℃冰箱中储藏。分别于第1、21、35、56 d测定全血加标样品和干血斑加标样品中的药物含量，比较药物在干血斑和全血中含量的比值随时间的变化情况。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

考察了0.01%甲酸水溶液-甲醇和0.01%甲酸水溶液-乙腈2 种流动相体系对各化合物的分离效果。结果表明，以0.01%甲酸水溶液-乙腈为流动相时各化合物的峰形较好，且各色谱峰能彼此分离。向流动相中加入一定浓度的甲酸铵，比较色谱峰的丰度，结果表明，当加入1 mmol/L 甲酸铵时，大多数化合物的响应有一定增加，因此选择流动相为1 mmol/L 甲酸铵-0.01%甲酸水溶液和乙腈体系。29种β2-受体激动剂的选择离子流图如图1所示。

图1 29种β2-受体激动剂的选择离子流图Fig.1 The selected ion chromatograms of 29 β2-agonists

2.2 提取条件的优化

比较了甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇和甲醇-乙腈（1∶1）4 种提取溶剂对干血斑中目标物的提取效果（见图2）。结果表明，当提取溶剂为甲醇时干血斑中目标物的整体提取率较大，回收率为62.7%～118%；采用1%甲酸甲醇提取时，除沙丁胺醇、3-甲氧酪胺、非诺特罗和丙卡特罗之外，其余目标物的回收率均有所下降；使用乙腈提取时，回收率下降明显；采用甲醇-乙腈（1∶1）提取时，除丙卡特罗外，其余目标物的回收率均小于甲醇提取时的回收率。因此使用甲醇对采血卡上的干血斑进行提取。当血滴加在采血卡表面时，血中的大分子蛋白和小分子目标物被充分吸附在采血卡基质中。有机溶剂的加入使干燥的血斑表面更加失水，导致蛋白聚合，甲醇沉淀蛋白时多为絮状，而乙腈对蛋白的沉淀效果更明显，可使血斑表面被大面积聚合蛋白覆盖而无法析出，因此甲醇更适合对干血斑提取。

图2 不同溶剂对目标物的提取效果Fig.2 Extraction effects of different extraction solvents for analytes

考察了干血斑和甲醇的体积比分别为1∶5、1∶10和1∶15时对目标物提取效率的影响，结果表明，当两者的体积比为1∶5时，一部分甲醇润湿在采血卡纤维素基质中，导致上清液较少且基质效应大；当体积比为1∶10和1∶15时，目标物的回收率无明显差异，最终选择血斑和甲醇的体积比为1∶10。

2.3 线性范围与检出限

制备一系列质量浓度为1～200 ng·mL-1的干血斑样本，按照“1.2”方法处理后进行UPLC-MS/MS 分析，以干血斑中目标分析物的质量浓度为横坐标，对应定量离子的峰面积为纵坐标拟合标准曲线。结果表明，29种化合物在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）为0.995 8～0.999 9，满足方法学要求。以3 倍信噪比（S/N= 3）所对应的质量浓度作为方法检出限（LOD），29 种化合物的LOD为1～10 ng·mL-1（见表1）。

2.4 回收率与基质效应

通过在空白血中添加标准溶液制备干血斑样本，考察29 种β2-受体激动剂的回收率、基质效应和重复性，3-甲氧酪胺和多巴胺的加标水平为40、100 ng·mL-1，其余27 种化合物则为10、40、100 ng·mL-1，每个加标水平平行5 次，按照“1.2”方法进行处理。按以下方法计算回收率和基质效应：回收率=B/A×100%，基质效应=A/C×100%，其中A为空白干血斑基质处理后添加相同含量β2-受体激动剂的响应值，B为添加相同含量β2-受体激动剂的干血斑处理后的响应值，C为与空白基质加标样本同一浓度的标准溶液的响应值。如表2 所示，除非诺特罗外，干血斑中其余28 种化合物的回收率为60.9%～124%，相对标准偏差（RSD）均小于20%，可满足检测要求。非诺特罗的回收率虽仅为26.9%～65.5%，但可用于药物的筛查定性。本文以采血卡为干血斑的存储介质，采血卡的纤维结构一定程度上吸附了血液中磷脂、多糖等干扰物质，降低了血液基质的干扰，但也不可避免地引入采血卡中某些化学试剂，对目标物的响应起到增强或抑制的效果。例如，基质对齐帕特罗、丙卡特罗和福莫特罗起到增强作用，对利托君、克伦塞罗、莱克多巴胺和拉贝洛尔起到较强的抑制作用，但均可满足药物的筛查定性要求。

以40 ng·mL-1加标水平的干血斑为考察对象，按照“1.2”方法进行处理，连续进样5 d，每天重复5次，计算每日平均值的RSD作为日间精密度。如表2所示，日间RSD为3.2%～19%，可满足检测要求。

表2 29种β2-受体激动剂的回收率、基质效应和精密度Table 2 Recoveries，matrix effects and precision results of 29 β2-agonists

2.5 干血斑的稳定性

为考察29 种β2-受体激动剂在所制备干血斑中的稳定性，将全血和干血斑的加标样品置于-20 ℃冰箱中储藏，比较29 种化合物在两种基质中含量的比值（C血斑/C全血）随时间的变化情况。若比值增大，表明血斑中的化合物较全血稳定；反之，全血中化合物稳定。结果显示，C血斑/C全血在8 周内变化不显著，因此在-20 ℃的冰箱储存环境下，29种目标物在干血斑和全血中具有相同的稳定性，均能稳定保存8 周。干血斑在保存过程中，酶和蛋白由于处于失水状态而失活，化合物的转化、降解等化学反应受到抑制，化合物更加稳定。同时细菌作用也受到抑制，更利于样本的长期保存。

2.6 实际样品的检测

采用本文建立的方法对10 份血液进行前处理和分析，均未检出上述29 种β2-受体激动剂。选取其中3 份血液，加入29 种β2-受体激动剂标准溶液，使加标浓度为50、150 ng·mL-1，按照本方法进行分析，得29种β2-受体激动剂的加标回收率为65.3%～106%，表明所建方法可用于实际样品检验。

3 结 论

本研究以Whatman 903 采血卡为全血样品的采集和储存基质，采用超高效液相色谱-串联质谱对干血斑中的29种β2-受体激动剂进行定性定量分析。结果表明，在最优条件下，除非诺特罗外，其余目标物的回收率为60.9%～124%，RSD 均小于20%，干血斑在-20 ℃下保存8 周后与全血样本具有相同的稳定性。该方法准确、样品用量小，保存和运输便利，可应用于法庭毒物分析领域。