五味子醇甲对脑缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响

杨继苹，臧 瑞，李 正，杨利强，徐伟杰，武煜明，邓仪昊

缺血性脑卒中是我国发病率、致残率、死亡率相对较高的一种疾病，中医将其归为“中风”“偏枯”等范畴。中风，有内风和外风之别。外风多因感受“六淫”之首的风邪所致，风性善行数变，易袭阳位，能使皮肤腠理开泄。故而出现恶风、汗出、头痛、皮肤瘙痒等症状。临床中风病人多属于内风，系由内伤病证所致，又称脑卒中。针对脑缺血，西医治疗在超早期(即起病在3～6 h内)主要是溶栓、应用抗凝剂，后期主要采取功能康复锻炼等治疗，但大部分病人治疗后神经功能恢复收效颇微，严重残疾者可达40%以上[1-3]。通过数年的临床及基础研究，虽然对缺血性脑卒中的发生机制有了进一步了解，但真正用于治疗的神经保护药物却很少。目前主要溶栓药物为组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，但其应用时间窗短，因此，约50%以上的病人治疗后仍有神经功能障碍等后遗症，严重影响病人及家属生活质量，加重家庭、社会经济负担。

五味子醇甲是五味子木脂素中药理活性作用较强的有效成分，研究发现五味子对中枢神经系统影响广泛，其能通过抑制细胞色素介导作用、调节氨基丁酸水平等，从而发挥较好的镇静、催眠、改善抑郁及治疗脑卒中、帕金森病作用，通过调控Janus激酶2(JAK2)/信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)信号通路抑制神经胶质细胞介导的神经损伤[4-6]。现有研究表明，地黄饮子血中的移行成分主要来源于五味子，因此，五味子被认为是地黄饮子入血后成分的主要来源药材[7]。给家兔灌喂地黄饮子汤剂后，通过脑脊液检测分析，追溯其来源后发现了五味子醇甲，其是地黄饮子中唯一存在于脑脊液中的有效成分[8-11]。前期实验研究发现，五味子醇甲既能够促进体外培养的神经干细胞增殖、分化，又能诱导缺血半影区神经元自噬，促进大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠神经功能的恢复、脑梗死面积的减少，从而发挥脑保护作用[12-13]。但五味子醇甲能否促进脑缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区内源性神经干细胞增殖的机制尚缺乏系统研究。本研究探讨五味子醇甲促进脑缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区神经干细胞增殖分化的潜在机制，为进一步探讨五味子醇甲促进神经干细胞增殖分化的分子机制奠定动物实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级、体质量250～280 g的SD雄性大鼠90只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，于室温18～26 ℃正常喂养。

1.2 药品与试剂 五味子醇甲购自Selleck生物科技公司，使用前用二甲基亚砜(DMSO)将其稀释至所需浓度备用。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔、β-肌动蛋白(β-actin)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)等均购自于Abcam公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)试剂购自北京索莱宝公司。

1.3 实验仪器 荧光显微镜购自日本尼康公司，脑立体定位仪、微量注射泵购于上海玉研科学仪器有限公司，冰冻离心机购自莱卡。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 90只SD雄性大鼠随机选30只通过TTC染色测量脑梗死面积并进行神经功能缺损评分，30只用于蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测，30只大鼠用于免疫荧光检测。随机分为5组：假手术组、MCAO组、五味子醇甲低剂量组[40 μg/(kg·d)]、五味子醇甲中剂量组[80 μg/(kg·d)]、五味子醇甲高剂量组[160 μg/(kg·d)]。

1.4.2 造模 参照Zea Longa法用MCAO线栓法制作大脑中动脉栓塞模型[14]。方法如下：SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(360 mg/kg)进行深度麻醉，钝性分离肌肉及周围组织，暴露分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，经颈外动脉的小切口插入MCAO栓线，距离血管分叉处(18±2)mm进入左大脑中动脉进行闭塞，并于颈外动脉远端结扎该动脉，固定线栓。MCAO组及给药组大鼠于术后90 min取出栓线以实现再灌注。

1.4.3 给药方法 用10%水合氯醛(360 mg/kg)将大鼠深度麻醉后取俯卧位，用脑立体定位仪固定，确定给药管的下管位置(前囟后约0.9 mm，距中线旁约1.4 mm，距硬脑膜深约4.0 mm)。牙科钻开孔，固定给药套管。五味子醇甲低剂量组、五味子醇甲中剂量组、五味子醇甲高剂量组SD大鼠左侧脑室用微量进样器通过给药管给予五味子醇甲，药量为每天5 μL，速度为1 μL/min，疗程为7 d。假手术组SD大鼠则给予对照剂，给药结束后留针5 min。此外，免疫荧光所有组别SD大鼠单独通过腹腔再给予5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)每天50 mg/kg，连续给药7 d[15]。

1.4.4 Western Blot检测 给药7 d后每组随机抽取6只大鼠，麻醉后迅速断头取脑，在冰上取左侧大脑的室管膜下区组织制备蛋白样本，BCA法检测各组样本蛋白浓度。配分离胶，上样、电泳，转膜，封闭2 h后标一抗，4 ℃摇床孵育1 h后4 ℃冰箱过夜。次日，洗膜、HRP标记的二抗稀释液封膜、孵育2 h、加ECL化学发光底物、暗盒压片。蛋白条带用Image J软件进行灰度值分析。

1.4.5 免疫荧光检测 给药7 d后每组随机抽取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉，4%多聚甲醛灌流，快速冰冻切片，切片厚度约为20 μm。脑片经0.2% TritonX-100室温孵育透化、10%牛血清白蛋白溶液(BSA)室温封闭、滴加一抗封闭过夜。第2天滴加荧光二抗室温避光孵育1 h、DAPI复染细胞核、抗淬灭剂封片处理后通过荧光显微镜对各组脑片的室管膜下区进行拍照。

2 结 果

2.1 五味子醇甲对MCAO大鼠脑梗死面积的影响 在MCAO术后第7天处死SD大鼠，进行TTC染色，计算其脑梗死面积。结果显示：与MCAO组比较，五味子醇甲治疗后SD大鼠脑梗死面积缩小明显，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，随着药物浓度的增加，SD大鼠的脑梗死面积逐渐减小。由此推测五味子醇甲能减轻MCAO大鼠的脑组织损伤，且高剂量的五味子醇甲对MCAO大鼠脑组织的神经保护作用最明显。详见图1。

与MCAO组比较，＊ P<0.05，# P<0.01。

2.2 Western Blot检测五味子醇甲对MCAO大鼠室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响 研究证实巢蛋白(Nestin)能作为神经干细胞的标志蛋白，抗神经细胞核蛋白(Hu)作为神经元的标志蛋白[15-16]。为了研究五味子醇甲对MCAO大鼠室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响，分别用Nestin和Hu抗体进行Western Blot实验。图2结果显示：与假手术组比较，MCAO组、五味子醇甲低剂量组、五味子醇甲中剂量组、五味子醇甲高剂量组神经干细胞增殖标记的Nestin蛋白、Hu蛋白表达增高；与MCAO组比较，五味子醇甲高剂量组Nestin蛋白、Hu蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明高剂量五味子醇甲干预后神经干细胞增殖较明显，即高剂量五味子醇甲干预后神经干细胞明显分化为神经元。由此推测，五味子醇甲能够上调Nestin和Hu蛋白表达而促进缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区神经干细胞增殖、分化，从而发挥神经保护作用，且高剂量的五味子醇甲的神经保护作用最明显。

与MCAO组比较，＊ P<0.05；与假手术组比较，# P<0.01。

2.3 免疫荧光法评估五味子醇甲对MCAO大鼠室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响 Brdu作为细胞增殖的标记蛋白，通过观察Brdu和DAPI融合成的荧光显微图像评估神经干细胞的增殖情况[18]。免疫荧光分析结果(见图3)进一步证明，与MCAO组比较，大鼠大脑中动脉栓塞再灌注后五味子醇甲高剂量组Brdu标记的阳性神经干细胞比例明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但五味子醇甲低剂量组、五味子醇甲中剂量组Brdu标记的阳性神经干细胞比例虽有一定增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。由此得出，五味子醇甲高剂量组对神经干细胞增殖的促进作用最明显。Hu作为神经干细胞分化为神经元的标志蛋白，通过观察Hu和DAPI融合成的荧光显微图像评估神经干细胞的分化情况发现，大脑中动脉栓塞再灌注后，神经干细胞的分化作用不明显，但给予五味子醇甲干预治疗后神经干细胞开始分化为神经元，与MCAO组比较，五味子醇甲高、中、低剂量组治疗后SD大鼠Hu蛋白标记的阳性神经元数量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且高剂量五味子醇甲干预后SD大鼠Hu蛋白标记的阳性神经元数量升高最明显，差异有统计学意义(P<0.01)，详见图4，由此得出五味子醇甲干预治疗可促进神经干细胞分化为神经元，并且以高剂量的五味子醇甲作用最明显。

与MCAO组比较，＊ P<0.05；与假手术组比较，# P<0.01。

与MCAO组比较，＊ P<0.05；与假手术组比较，# P<0.01。

3 讨 论

缺血性脑卒中是我国常见病、多发病，随着高血压、高血脂、糖尿病等发病率的增长，使得脑卒中发生的潜在危险因素也增加，脑缺血再灌注后产生的损伤更是增加了该病的致死率和致残率。由于缺血性脑卒中导致神经系统受损，而受损组织通过神经元自身再生修复的可能性微乎其微，因此，本研究的中心为具有较强分化潜能和更新能力神经干细胞。长期以来，人们认为成年的哺乳动物中枢神经系统的神经细胞没有再生能力，然而近年来研究表明，成年的哺乳动物中枢神经系统的海马齿状回(DG)、室管膜下区(SVZ)仍然存在神经发生[17]。作为治疗中风所致后遗症、喑痱证的经典方剂“地黄饮子”已被证实其具有良好的神经保护作用，在肌肉萎缩、肢体痉挛和舌强不能言等诸多方面具有良好的疗效[18-19]。其机制主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)相关信号通路被激活、调节因子脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)的表达而促进内源性神经干细胞增殖、抗氧化应激等而达到神经保护作用[20-23]。五味子醇甲是五味子入血后的主要成分，且其能透过血脑屏障，药理作用广泛，可作用于心血管系统、生殖系统、消化系统等多个系统，然而其对中枢神经系统的作用不容忽视。五味子醇甲可提高海马区多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的含量而促进大鼠觉醒，并可提高大鼠记忆能力而保护大脑[24]。五味子醇甲可通过抑制小胶质细胞活化从而抑制脑内炎症反应而发挥脑保护作用[25]。五味子醇甲能减轻APP/PSI双转基因痴呆性小鼠神经细胞损伤和改善突触功能而预防阿尔茨海默病[26]。五味子醇甲既能够促进体外培养的神经干细胞增殖、分化[12]，又能诱导MCAO大鼠缺血半影区神经元自噬从而促进其神经功能的恢复而发挥神经保护作用[13]。

本研究发现，假手术组SD大鼠均未出现神经功能损伤，TTC染色未见梗死区；MCAO缺血再灌注后所有SD大鼠出现不同程度的脑梗死，五味子醇甲药物干预治疗后，脑梗面积明显缩小，且五味子醇甲高剂量组对减少术后SD大鼠脑梗死面积作用更明显，该结果与Zhou 等[9]的研究结论相一致，即高剂量组的五味子醇甲能够减轻神经功能损伤、降低神经功能评分，由此推测五味子醇甲对脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定的保护作用[13]。本研究通过Western Blot、免疫荧光组织化学法进行综合评估，结果表明：与假手术组和MCAO组比较，五味子醇甲高剂量组大鼠室管膜下区Nestin、Hu、Brdu蛋白表达均明显升高，且五味子醇甲低剂量组、五味子醇甲中剂量组比较差异无统计学意义，由此得出，五味子醇甲可能通过促进缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区神经干细胞增殖和分化相关蛋白Nestin、Brdu、Hu表达水平，从而促进室管膜下区神经干细胞增殖和分化为神经元，从而发挥脑缺血再灌注损伤保护作用，且高剂量的五味子醇甲治疗对神经干细胞增殖、分化作用更明显。

综上所述，本研究结果可能有助于进一步明确五味子醇甲促进神经功能恢复的病理机制研究，从而为丰富预防和治疗脑缺血的方法提供实验依据。