心肌梗死大鼠奥美沙坦酯灌胃后AT1受体和gp91phox表达变化的实验研究

刘建云，司晓燕，徐 鹏，李 勋

左室重构系心肌梗死(MI)后非梗死部位心肌细胞日趋肥大，间质进行性纤维化，左室不断扩张所造成的，其后果是导致左室收缩功能下降，进而出现心力衰竭[1]。虽然心肌梗死后介入治疗及新型药物的使用对心肌梗死后心功能有一定的改善，但心肌梗死后心功能减退仍然是危害重大的公众健康问题[2]。探究心肌梗死后左室重构机制，对于预防心肌梗死后左室重构，防止心力衰竭的发生发展及改善心肌梗死病人的预后至关重要。肾素-血管紧张素系统(RAS)已被证实以超氧阴离子自由基(O2-)为媒介诱导左室重构，而尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)也被多项研究证实在心肌梗死后左室重构中发挥重要作用[3-5]。而RAS与NOX之间及其与左室重构之间的联系目前尚未清晰。本研究通过检测心肌梗死大鼠灌胃奥美沙坦酯(OLM)后，非梗死部位心肌组织中的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)1型(AT1)受体mRNA、NOX亚单位中gp91phoxmRNA及其蛋白的表达程度、O2-浓度、NOX活性，并进行线性相关分析，旨在探究RAS和NOX在心肌梗死后表达的变化及二者之间的联系，及其对左室重构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Trizol、逆转录及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPHD)均购于Invitrogen生命技术公司(美国)；O2-及NOX检测试剂盒均购自碧云天生物试剂有限公司(中国)；蛋白预染Marker、免抗-NOX2/gp91phox、HRP-Goat anti-Rabbit IgG均购自KPC公司(美国)；无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠，体质量270～380 g，购自苏州大学附属第一人民医院动物实验中心。

1.2 大鼠心肌梗死模型制备 大鼠称重后随机分为对照组、奥美沙坦酯组、安慰剂组。3%戊巴比妥(2 mL/kg)腹腔注射，全身麻醉后开胸，对照组仅用5-0线穿绕而不结扎左前降支(LAD)血管，其余两组用5-0线结扎LAD，建立心肌梗死模型，奥美沙坦酯组于术后第2天予奥美沙坦酯(10 mg/kg，每天1次)灌胃4周；安慰剂组经灌胃注入等容积蒸馏水4周。

1.3 检测左室质量指数(LVMI) 4周后共25只大鼠存活，其中对照组10只，安慰剂组6只，奥美沙坦酯组9只。称重后摘出心脏并留取左室，可见梗死区为灰白地图状梗死灶(见图1)，称重。计算LVMI：LVMI=左室质量(mg)÷体质量(g)。

图1 各组左室标本(左室前壁观)

1.4 检测AT1受体mRNA及NOX亚单位gp91phoxmRNA表达程度 将左室的非梗死部位中心肌组织的总RNA提取出后，以qRT-qPCR法检测。引物序列，①AT1受体：正向引物GAGTCCTGTTCCACCCGATCACCGATCAC，反向引物GGATGACGCCCAGCTGAATCAGCACATCC，扩增长度1 046 bp；②gp91phox：正向引物CAGCCTGCCTGAATTTCAACT，反向引物GGAGAGGAGATTCCGACACACT，扩增长度254 bp；③β-actin：正向引物CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反向引物 TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，扩增长度241 bp。反应体系如下：待检测cDNA模板2 μL，靶基因AT1受体或gp91phox和β-actin正向、反向引物各2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)25 μL，单蒸水18 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)1 μL。两步法PCR扩增条件：95 ℃，30 s，1个循环，完成预变性；95 ℃，5 s变性后退火，60 ℃，34 s，40个循环。使用荧光实时定量功能PCR仪来跟踪反应，应用软件(Real-Time PCR System)绘出各组基因的扩增、溶解曲线。采用2-△△Ct法分析各组基因表达程度的变化[6]。

1.5 NOX亚单位gp91phox蛋白表达分析 裂解左室中非梗死部位的心肌组织后离心，提纯蛋白并测定其浓度。将电泳之后的所有样本转膜到备好的硝酸酯纤维素膜，使用双蒸水来洗膜，10 min×3次将免抗-Nox2/gp91phox(一抗)和GAPHD予封闭液稀释(1∶100)。分别将转膜后样本放至上述稀释液中，并置于4 ℃恒温摇床上孵育过夜，再次洗膜，5 min×3次，将膜置于用封闭液稀释的HRP-Goat anti-Rabbit IgG(二抗)溶液(1∶500)中，摇床25 ℃恒温孵育2 h，再洗膜5 min×3次。加入发光底物胶片感光显影后，采用凝胶分析软件测算条带灰度，得出所测蛋白同GAPHD的灰度比值。

1.6 O2-浓度及NOX活性的检测 采用WST-1还原法。裂解左室中非梗死部位的心肌组织后离心取出上清液，检测A450(450 nm波长处的吸光度)，计算公式：O2-浓度=A450÷蛋白含量(RLU/mg)。然后加入NADPH试剂(1 mmol/L)5 μL再测A450。计算公式：NOX活性=[加NADPH后A450-加NADPH前A450]÷蛋白含量(RLU/mg)。

2 结 果

2.1 LVMI比较 安慰剂组LVMI高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组指标比较

2.2 AT1受体mRNA及gp91phoxmRNA表达程度比较 安慰剂组AT1受体mRNA的表达程度高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)；安慰剂组gp91phoxmRNA的表达程度高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

2.3 gp91phox蛋白表达程度比较 安慰剂组gp91phox蛋白同内参GAPHD的灰度比高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

图2 3组gp91phox及内参GAPHD蛋白的表达

2.4 O2-浓度及NOX活性比较 安慰剂组O2-浓度高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)；安慰剂组NOX活性高于对照组及奥美沙坦酯组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.5 gp91phoxmRNA和AT1受体mRNA表达程度、O2-浓度和NOX活性及gp91phoxmRNA之间的相关性分析 gp91phoxmRNA和AT1受体mRNA呈正相关(r=0.729，P<0.05)，O2-浓度和NOX活性呈正相关(r=0.843，P<0.05)，O2-浓度和gp91phoxmRNA亦呈正相关(r=0.735，P<0.05)。

3 讨 论

心肌梗死发生后激活RAS和NOX以维持血流动力学的稳定，然而他们被激活后同时引发了非梗死部位心肌肥厚、心腔扩大、收缩力降低、顺应性下降，进一步引发心力衰竭，严重时可致死亡[7-8]。激活后的RAS加速了AngⅡ的合成，而几乎所有的AngⅡ参与心血管调节作用的必经之路就是AT1受体，因此，AT1受体的含量会在心肌梗死后增多，本研究中安慰剂组非梗死部位的组织中AT1受体mRNA的表达程度高于对照组，也证实了这一点。亦有研究发现心肌梗死后非梗死部位的心肌组织中AT1受体密度也会增大[9]。此外，本研究还得出安慰剂组非梗死部位的NOX活性和O2-浓度均较对照组升高；且NOX亚单位gp91phoxmRNA和蛋白表达程度较对照组均升高，由此推测，AT1受体及NOX于心肌梗死后合成均增多。曾有研究发现NOX可间接被AngⅡ激活，而具体途径尚不明确[10]。本研究中，安慰剂组大鼠非梗死部位中AT1受体mRNA与gp91phoxmRNA的表达程度呈正相关，提示AT1受体及NOX之间并不是孤立的，而且本研究中O2-浓度亦与gp91phoxmRNA的表达程度及活性均呈正相关，因此认为心肌梗死后被激活的RAS产生了过多的AngⅡ，由AT1受体介导作用于NOX亚单位gp91phox，从而使NOX合成增多且活性增高，进而产生过量O2-。心肌重构系过多的O2-导致心肌氧化应激反应加剧，进而引发细胞膜和细胞内蛋白均被破坏，因此加快了心肌细胞的坏死甚至凋亡，此结论早已被证实[11]。该研究中，安慰剂组大鼠LVMI高于对照组，且先前的研究明确了LVMI和NOX活性之间存在正相关，故测定NOX活性可用来评估心肌梗死后心脏发生左室重构的严重程度[5]。心肌梗死后，NOX激活产生的过量O2-参与了左室重构的发生发展过程，而且起到了举足轻重的作用，而RAS系统激活后产生的AngⅡ是心肌梗死后NOX被激活的重要源头，AT1受体与NOX亚单位gp91phox之间的联系可能是心肌梗死后NOX被AngⅡ激活的重要通路。

本研究发现，奥美沙坦酯组非梗死部位的心肌组织中，AT1受体mRNA的表达程度低于安慰剂组，提示奥美沙坦酯除可阻断AT1受体外，还能通过减少AT1受体的数目来产生效应，曲秀芬等[12]的研究也得出了相似结论。此外，本研究中奥美沙坦酯组大鼠予奥美沙坦酯灌胃4周后，非梗死部位的心肌组织中gp91phoxmRNA及其蛋白的表达程度、NOX活性及O2-浓度同安慰剂组相比均减低。有研究在心肌梗死面积相似的前提下敲除大鼠gp91phox基因，发现敲除后大鼠左室重构程度较野生型明显减轻[13]。从本研究大鼠解剖得到的左室标本也可以看出，安慰剂组较对照组左室前壁梗死灶变成灰白色，明显变薄呈地图状，切开后几乎仅见到纤维组织，非梗死部位的心肌较对照组明显肥厚，左心腔内径大于对照组，且该组LVMI较高，显而易见，左室发生了重构；而奥美沙坦酯组与安慰剂组相比，左室心肌纤维化区域面积明显缩小，左心腔内径无明显扩大，且LVMI较低，左室重构程度较轻。至此，RAS系统可以激活NOX被进一步证实，AT1受体被奥美沙坦酯阻断后能使NOX的表达程度减低，并使其活性下降，致使O2-的产生减少，从而延缓左室重构。

心肌梗死后，RAS和NOX介导的左室重构在进行性的心力衰竭的演化过程中均扮演着关键性的角色。心肌梗死使RAS系统激活后，AT1受体数量及密度均增加，过量的AT1受体作用于NOX亚单位gp91phox，进一步激活NOX，二者协同作用造成左室重构程度加剧，而奥美沙坦酯可抑制这一过程。虽然RAS系统抑制剂的广泛应用使心肌梗死后心力衰竭病人得到获益，但心力衰竭仍是世界范围内高发且危害重大疾患之一，而NOX抑制剂仍在研发中。本研究证实了RAS系统可以激活NOX，使心肌梗死后左室重构机制得到进一步充实，使NOX的调节及其在左室重构过程中的作用更加明朗，强化AngⅡ阻滞剂应用可能会使心肌梗死后的左室重构得到进一步延缓、抑制甚至逆转。