基于网络药理学联合分子对接研究六磨汤治疗肿瘤性肠梗阻的作用机制

赵 聪，刘宝清，杨成城，张少辉，李 乔，孟 莹，安佳琳

目前结肠及直肠肿瘤发病率较前明显提高[1]，肠道肿瘤引起的肠梗阻具有腹痛、呕吐、腹胀及停止排气排便等一般肠梗阻的特点，同时因肿瘤对人体的打击，患者对肠梗阻的耐受较低，死亡率较一般肠梗阻高[2]。目前西医治疗肠梗阻以维持水电解质及酸碱平衡、抗炎、抗感染及手术治疗为主，但单纯西医治疗存在复发率较高及患者生存质量较低且对家庭经济压力较大等问题[3]。中医可针对病因病机，发挥整体辨证优势，通过中药灌肠、针灸及穴位贴敷等多种方式对肿瘤性肠梗阻进行干预，临床实践中应对其积极推广。

《内经》云：“六腑者泻而不藏,实而不能满”，治疗以通为主。六磨汤出自《世医得效方》，此方的药物组成为槟榔、沉香、木香、乌药、大黄、枳壳，其主要功效为破气宽中，通泄降逆。研究表明，六磨汤不仅可以通过灌肠、敷脐等多种治疗方式有效改善肿瘤晚期患者肠梗阻症状，还可以提高患者生存质量，促进患者康复[4-10]。

网络药理学是基于多向药理学、网络生物学，并通过数据分析、疾病及药物数据库检索、计算机模拟等方式，以预测“药物-靶点-疾病”之间联系的一种方法。网络药理学具有整体性、系统性的特点，这与中医的“整体观念”有着异曲同工之处[11-12]。本研究是在网络药理学联合分子对接研究方法的基础上，探讨六磨汤治疗肿瘤性肠梗阻的作用机制，以期为六磨汤的深入研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 六磨汤中潜在靶点及其化合物预测 利用TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索槟榔、沉香、木香、乌药、大黄、枳壳的化学成分及靶点。根据药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性指数（drug likeness，DL）≥0.18 筛选有效化学成分[13]。将由TCMSP 数据库筛选得出的药物靶点数据与Uniprot 数据库(https://www.Uniprot.org)对比，得出有效靶点。

1.2 疾病的靶点收集 通过检索GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数据（https://www.omim.org/）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB数据库（https://www.pharmgkb.org/），以“Tumor Intestinal Obstruction”为关键词，得到肿瘤性肠梗阻的相关靶点和基因。

1.3 六磨汤与肿瘤性肠梗阻共同靶点的筛选 将药物化合物、肿瘤性肠梗阻的相关靶点利用R 软件中的 Draw Venn Diagrams 工具获取化合物治疗疾病的共同靶点。

1.4 蛋白质相互作用（Protein Protein interaction，PPI）网络构建及核心靶点筛选 将交集靶点蛋白输入STRING 数据库制作PPI 网络进行分析，并利用Cytoscape3.8.0 软件对获得的交集靶点蛋白进行可视化处理，通过CytoNCA 进行网络拓扑分析得出核心靶点。

1.5 基因富集分析 通过R 语言中的“cluster Pro filer”“DOSE”“enrich plot”等程序包进行GO 功能富集分析,进一步探索中药活性成分的靶点蛋白在基因功能中的作用。通过R 语言中的“cluster Pro filer”“org.Hs.eg.db”“enrich plot”、“ggplot2”等程序包对交集基因进行KEGG 功能富集分析,进一步阐释中药活性成分的靶点蛋白在通路功能中的作用。

1.6 六磨汤核心化学成分与关键靶基因的分子对接验证 首先通过PubChem 数据库下载小分子配体文件，使用Chem Office 软件构建小分子配体的3D 结构。再从PDB 数据库下载关键蛋白的3D 结构，使用PyMOL 软件进行去水、去有机物操作。使用利用Auto Dock 软件将活性成分结合，寻找活性口袋。筛选出同样作用于药物与疾病的分子进行对接研究，最后使用PyMOL 软件构建完整的分子对接图。

2 结果

2.1 六磨汤成分的收集及对应的潜在靶点信息分析 通过TCMSP 检索到制槟榔化合物7 个，沉香化合物9 个，木香化合物6 个，乌药化合物9 个，大黄化合物16 个，枳壳化合物5 个，见表1。这些化合物包括：β-谷甾醇、川陈皮素、芦荟大黄素、槲皮素、柚皮素等，见表2。与UniProt 数据库对药物靶基因进行校正分析，并剔除重复，得到六磨汤化合物的相关靶点基因25 个。检索多个数据库得到肿瘤性肠梗阻的相关靶点6 530 个，将六磨汤与肠梗阻的潜在靶点经过韦恩分析后，获得两者的共有交集179 个靶点。韦恩图见图1，药物有效化合物和疾病靶点的相互关系见图2。

图1 复方-疾病交集基因韦恩图

图2 复方化学成分-靶点作用网络

表1 六磨汤中药-成分-靶点信息

表2 六磨汤的有效成分

续表2

2.2 网络构建与分析 将交集靶点通过STRING数据库检索得出靶点蛋白互作网络，其中共含160 个节点和701 条相互作用关系，再使用Cytoscape3.8.0 软件可视化处理，见图3。使用CytoNCA 插件对所得的 PPI 作用网络进行进拓扑分析，得出核心靶点有TP53、RB1、PRKCB、MAPK3、MYC、MAPK14 等，见表3。

表3 核心靶点

图3 PPI 网络

2.3 六磨汤治疗肠梗阻靶点的富集分析 将六磨汤治疗肠梗阻的共有靶点进行GO 富集分析，得到P＜0.05 的生物学功能条目2 722 条，其中P＜0.05 的生物过程、细胞成分、分子功能条目分别有2 425、92、205 条，各选取前20 条进行可视化，可见复方药中的活性成分作用的靶点主要富集在细胞对化学应激的反应、对营养水平的反应、对氧化应激的反应、对药物的反应等；在细胞组成中膜筏、膜微结构域、膜区域所占比例最大；在分子功能方面，DNA 活化转录因子结合、RNA 聚合酶II 转录因子结合、核受体活性排位靠前。见图4。

图4 GO 富集

将六磨汤治疗肠梗阻的共有靶点进行KEGG通路富集分析，筛选得到P＜0.05 的条目158 条，选取P＜0.05 且与肠梗阻相关的20 条进行可视化展示，见图5。其中前20 条相关通路的富集，主要涉及结肠直肠癌信号通路（Colorectal cancer）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3KAkt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）等。

图5 KEGG 通路富集图

2.4 六磨汤核心成分作用于核心靶点的分子对接验证 六磨汤核心有效化学成分为柚皮素、槲皮素（表4），PPI 网中核心靶点且Degree 值较高为AKT1、JUN、MAPK1、MAPK3、RELA、TP53。目前公认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低,发生的作用可能性越大，具体分子结合能见表4，分子对接结果见图6～11。

图6 柚皮素-AKT1 分子对接

表4 六磨汤中部分核心化学成分与核心靶点的结合能

图7 柚皮素-JUN 分子对接

图8 槲皮素-MAPK1 分子对接

图9 槲皮素-MAPK3 分子对接

图10 槲皮素-RELA 分子对接

图11 槲皮素-TP53 分子对接

3 讨论

六磨汤中部分活性成分较多，如槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素等。槲皮素具有较强的抗炎作用[14]，其通过抑制白细胞介素（IL）-6 等炎性因子的表达起到抗炎作用[15]；槲皮素是一种具有广谱抗菌作用的一种植物性抗菌剂[16]，且在人体内外都可发挥抗菌作用[17]，并可有效调节肠道菌群[18]，相关研究表明，肠道菌群改善可降低肿瘤化疗不良反应及提高肿瘤化疗效果[19]；同时槲皮素亦可以通过诱导肿瘤细胞的凋亡达到抗肿瘤作用。β-谷甾醇通过抑制炎症小体的激活，进而抑制细胞中炎性因子如IL-6、IL-8 等达到抗炎效果；其还可以通过增多抗菌肽的表达及增加与病原微生物的结合位点，同时增加巨噬细胞的活性调节免疫[20]，从而起到抗菌作用[21]；同时β-谷甾醇或可以通过调节VEGF 等肿瘤相关基因的表达，以抑制癌细胞异常增殖、分化，从而起到抗肿瘤的作用[22]。柚皮素可以通过抑制肿瘤细胞的异常增殖及诱导肿瘤细胞凋亡以达到抗肿瘤的作用[23]；并且通过降低环氧化酶2 的表达，以抑制炎性因子的表达起到抗炎作用[24]。六磨汤中各组成中药可以通过多种活性成分综合作用，不仅对肠道肿瘤的发生及发展进行干预，还可以改善患者肠梗阻症状，提高患者的生存质量。

通过GO 富集分析显示，靶点主要富集合在细胞对化学应激的反应、对营养水平的反应、对氧化应激，肿瘤性肠梗阻因肿瘤扩散严重影响患者肠道功能，六磨汤可降低肠道应激反应，促进肠道功能恢复，提高营养物质的吸收，改善患者生活质量。KEGG 富集分析结果提示，六磨汤或可调节IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3KAkt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）及结肠直肠癌信号通路（Colorectal cancer）等信号通路。IL-17 信号通路主要作用于IL-17 炎性因子，IL-17 炎性因子的降低是疾病缓解的重要标志[25]。PI3K/AKT 信号通路是人体重要的信号通路，其可参与多种人体生物活动，尤对肿瘤的发生及发展具有重要的调控作用。六磨汤可通过调节AKT1的表达以干预PI3K/AKT 信号通路以减少免疫反应及炎症反应[26]。HIF-1 是介导机体对缺氧环境适应性反应的关键转录激活因子，能够随着细胞中氧浓度的变化而改变基因表达[27]。同时六磨汤可直接作用于结肠直肠癌信号通路，并通过对药物-疾病交集靶点进行蛋白互作分析，结果提示PPI 网络中核心靶点且Degree 值较高为MAPK1、MAPK3 等，MAPK 靶点基因的表达可能与结肠癌的发生及发展有关[28]，提示其可通过多通路及多靶点共同作用，对结肠及直肠肿瘤进行干预。肿瘤性肠梗阻患者在患病期间不仅因肠梗阻引起肠道菌群失常、全身炎症反应及全身营养失衡，还因肿瘤原因使得患者生活质量进一步下降。六磨汤可以通过调节多靶点基因、多条信号通路以达到提高患者免疫力、抑制炎症反应、调节肠道菌群及抗肿瘤作用，促进患者生活质量的提高为进一步临床治疗提供基础。

通过分子对接结果可见，各小分子配体与受体结合的结合能均≤-5.0 kcal/mol，提示槲皮素与AKT1、JUN、RELA、TP53 结合及柚皮素与MAPK1、MAPK3 结合构象稳定时能量较低，可发挥的作用可能较高。六磨汤可通过多种活性成分综合作用，发挥其可作用于多靶点、多通路的优势，针对在肿瘤性肠梗阻中发挥作用的多个高风险的基因靶点及信号通路进行干预。六磨汤通过发挥抗炎、抗菌及抗肿瘤等生物学作用以改善肿瘤性肠梗阻患者的生活质量。

综上所述，运用网络药理学联合分子对接的分析方法，探索六磨汤干预肿瘤性肠梗阻的作用机制。结果提示，六磨汤通过多活性成分共同作用以调节多靶点蛋白表达及信号通路，从而达到调节免疫功能、抑制炎症反应及抗肿瘤等生物学作用，以提高患者生存质量。同时本研究亦证实中医药具有可作用多靶点、多通路的优势。通过本研究期望为今后研究六磨汤作用机制的实验及六磨汤的临床合理应用提供参考。但该研究仍存在一定的局限性，仍需开展相应试验明确六磨汤对上述关键靶点和通路影响的准确性。