八珍汤对人皮肤成纤维细胞表皮细胞生长因子、转化生长因子β1 及血管内皮生长因子A 表达的影响

孔令臻，邢 捷

临床将经积极正规治疗1 个月以上仍不能愈合的溃疡定义为慢性难愈性溃疡，外伤、糖尿病、下肢静脉曲张等皆可引发，严重影响患者工作及生活质量[1]。针对慢性难愈性溃疡后期腐祛肌不生的临床难题，上海市名中医唐汉钧教授创新性地提出了祛瘀生肌和补虚生肌的治疗方法，而补益气血法是补虚生肌的重要方法，临床疗效显著[2]。慢性溃疡创面修复的快慢与肉芽组织的生长息息相关，创面肉芽组织的主要成分是成纤维细胞和毛细血管。慢性溃疡创面修复过程中皮肤成纤维细胞分泌的表皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子起关键性作用[3]。

八珍汤是补益气血的代表方剂，前期动物体内实验发现八珍汤内服能促进大鼠难愈性创面肉芽组织成纤维细胞增殖，加快创面肉芽组织生长，促进创面愈合[4-5]。本实验从体外实验角度进一步研究不同浓度八珍汤对体外培养人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响，探索中医药促进创面愈合的有效药物及其作用机制和合理浓度，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人表皮成纤维细胞(HSF)，购自上海中乔新舟生物科技有限公司(批号：02.ZQ0781)。

1.1.2 药物与试剂 八珍汤(《正体类要》)由党参9 g，白术9 g，茯苓9 g，熟地黄12 g，当归9 g，白芍药9 g，川芎6 g，甘草6 g 组成。将以上中药煎取、浓缩、冻存、升发后制备成冻干粉。党参，产地甘肃，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180208）；白术，产地安徽，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180327-1）；茯苓，产地湖北，上海万仕城药业有限公司（批号：180103-1）；熟地黄，产地河南，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180126）；当归，产地甘肃，上海养和堂中药饮片有限公司（批号：180411）；白芍药，产地安徽，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180331）；川芎，产地四川，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180122）；甘草，产地新疆，上海康桥中药饮片有限公司（批号：180323）。异丙醇，国药集团化学试剂有限公司（批号：8109218）；氯仿，国药集团化学试剂有限公司（批号：10006818）；Western转膜液，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0021B）；Trizol，美国Thermo Fisher Scientific 公司（批号：10296010）；SDS-PAGE 电泳液，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0014B）；Anti-EGF，英国Abcam 公司（批号：ab184265）；Anti-VEGF，英国Abcam 公司（批号：ab52917）；Anti-TGF-β，英国Abcam 公司（批号：ab179695）；10×TBS 溶液，中国Biosharp（BL608A）（批号：BL608A）；RIPA 裂解液，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0013B）；TEMED，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST728）；蛋白上样缓冲液（5×），上海碧云天生物技术有限公司（批号：550825）；Tween-20，BBI life science（批号：9005-64-5）；BSA Albumin Fraction V，德国Biofroxx 公司（批号：143065）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0010）；1 mol/L Tris-HCL，pH8.8，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST788）；1 mol/L Tris-HCL，pH6.8，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST768）；10%SDS，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST628）；APS，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST005）；无水乙醇，上海生工生物技术有限公司（批号：SII30256.01B）；PMSF，上海碧云天生物技术有限公司（批号：ST506）；PBS，美国Gibco公司（批号：AC10260338）；ECL 显色试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0018FS）；蛋白Marker，美国Thermo Fisher Scientific 公司（批号：26617）；CCK-8 试剂，中国GENVIEW 公司（批号：GK3607-500T）。

1.1.3 仪器 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂（型号：RE-2000A）；冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司（型号：LGJ-10D）；万分之一电子分析天平，德国Sartorius 公司（型号：BSA124S）；台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司（型号：5424R）；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司（型号：SB25-12DTD）；酶标仪，美国Biotek 公司（型号：Synergy H1MF）；倒置式显微镜，日本Nikon 公司（型号：TS-100）；流式细胞分析仪，美国Beckman coulter 公司（型号：Cytoflex）；蜗旋振荡器，江苏其林贝仪器制造有限公司（型号：QL861）；30L 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂（型号：BXM-30R）；Adventurer 精密天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司（型号：AR224CN）；二氧化碳细胞培养箱，美国Thermo Scientific 公司（型号：371）；凝胶图像分析系统，上海勤翔科学仪器有限公司(型号：Chemiscope6300)；搅拌器，其林贝尔仪器制造有限公司(型号：GL-3250B)；掌上型离心机，美国Thermo Scientific 公司（型号：MYSPIN6）；恒温水浴锅，上海华连公司（型号：DK-S12）；-80 ℃冰箱，美国Thermo Fisher Scientific 公司（型号：700）。

1.2 细胞培养 人皮肤成纤维细胞复苏转移至37℃，于5%CO2培养箱中继续培养；培养24 h 后先在显微镜下观察细胞生长状态，然后将培养皿移至超净台内更换培养液，传代培养，将4～6 代细胞用于实验。

1.3 分组与干预 制备八珍汤冻干粉。对照组：予含完全DMEM 培养液细胞培养。不同浓度八珍汤组：予含10 μg/L～1 g/L 八珍汤的完全DMEM培养液细胞培养。

1.4 检测指标与方法 将人皮肤成纤维细胞进行复苏、传代、培养。选用第4～6 代细胞，在不同时间点采用CCK-8 法测定不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞增殖的影响，采用免疫印迹分析（Western blotting）法检测不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞合成分泌EGF、TGF-β1、VEGFA的影响。

1.4.1 细胞增殖 细胞铺板后药物干预细胞，将96 孔细胞板转移到超净台内，吸弃原培养液，每孔分别加入100 μL 的完全培养液，10 μg/L、100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L 的八珍汤，每组设置4 个副孔。将3 板96 孔细胞板重新移到37 ℃、5%CO2培养箱中，继续培养24 h及48h。检测光密度（OD）值：将96 孔细胞板转移到超净台内，吸弃原培养基，每孔加入100 μL完全培养基以及10 μL CCK-8 试剂，将96 孔细胞板转移到37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养1 h。1 h 后将96 孔细胞板移到酶标仪下于450 nm 波长处检测OD 值（OD450）。

1.4.2 EGF、TGF-β1、VEGFA 蛋白表达 细胞蛋白提取后用BCA 法测蛋白浓度，蛋白变性后电泳。配一抗，用5%BSA 按1︰1000 稀释一抗，滴加一抗于Parafilm 膜，将PVDF 膜小心覆盖于一抗上，4℃过夜。用1×PBST 洗涤4 次，每次10 min。配 二 抗，用5% BSA 以1︰10000 稀 释HRP 标记的二抗。滴加二抗于小盒中，膜置入小盒中，室温孵育60 min。用1×PBST 洗涤6 次，每次5 min。准备ECL 化学发光显色剂，将膜从PBST 中取出，用吸水纸稍吸干燥，滴加ECL 显色液，扫描及分析。一抗孵育，二抗孵育并显影。

1.5 统计学方法 实验数据用SPSS 21.0 统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，多组比较用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞增殖的影响 八珍汤（10 μg/L～1 g/L）干预人皮肤成纤维细胞24 h，与对照组相比较，八珍汤（100 μg/L～1 g/L）能促进细胞增殖，细胞生长数量差异有统计学意义（P＜0.05）。八珍汤（10 μg/L～1 g/L）干预人皮肤成纤维细胞48 h，与对照组相比较，细胞生长数量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同浓度八珍汤干预24 h 及48 h 对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

2.2 不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响 经过CCK-8 实验筛选，选择八珍汤作用人皮肤成纤维细胞24 h，检测低浓度（10 mg/L）、中浓度（100 mg/L）、高浓度（1 g/L）八珍汤对人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响。结果显示，与对照组比较，100 mg/L 八珍汤组EGF、TGF-β1 的表达増高，1 g/L 八珍汤组EGF、TGF-β1 表达降低（P<0.05）；10 mg/L 八珍汤组EGF、TGF-β1表达无明显差异（P>0.05）。与对照组比较，10 mg/L 八珍汤组VEGFA 的表达增高（P<0.05），100 mg/L 八珍汤组VEGFA 的表达明显增高（P<0.01），1 g/L 八珍汤组VEGFA 的表达无明显差异（P>0.05）。见图1、表2。

图1 不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响

表2 不同浓度八珍汤对人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响

3 讨论

中医认为皮肤溃疡的起发、破溃、收口与气血的盛衰息息相关，皮肤肌肉失于“气血”的温煦与濡养则易引起创面的发生，气血虚弱者创面不易愈合，预后不良。中医认为慢性溃疡气血两虚的患者应遵循补益气血的治疗方法，在治疗过程中，从“虚”入手，补益气血中药治疗慢性溃疡取得良好疗效[6]。八珍汤作为气血双补方剂，临床常用来治疗各种慢性疾病以及大病、久病病后虚弱，疮疡久不收口等气血两虚者，能通过提高血红蛋白以及红细胞改善血循环，在提高免疫力的同时，对皮肤也是一种保护[7-9]。

创面愈合过程主要包括炎症期、新生组织形成期及组织重塑期三个序贯交叉进行的阶段[10]。在新生组织形成期及组织重塑期，成纤维细胞被认为是重要的组织修复细胞，它能在修复过程中提供框架作用，在创面收缩过程中发挥至关重要的作用[11]。EGF 是细胞重要的有丝分裂原，促使细胞增殖、成熟，加速衰老细胞的替代及胶原蛋白合成，促进肉芽组织生长，同时能促进细胞迁移至受损部位，进而加速创面愈合[12-14]。VEGFA几乎参与了血管生成的整个过程。在血管生成过程中，VEGFA 作为VEGF 促进基底膜分解的主要因子，能加速血管新生。血管新生可为创面肉芽组织、细胞提供营养与氧气，在创面修复过程中起着重要作用。TGF-β1 在创面愈合过程中起着至关重要的作用，它可促进细胞增殖和分化并能促进细胞迁移，同时直接影响胶原的合成和分泌[15-16]。TGF-β1 是TGF-β 家族中的重要因子，它通过与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）结合而活化，通过TGFβ1-Smad 通路蛋白活化巨噬细胞，使其产生促血管化的细胞因子，同时促进成纤维细胞等修复细胞的增殖迁移以及改善创面炎症免疫反应，激化肉芽组织生长，诱导细胞外基质合成，完成创面重塑[17-19]。

前期动物实验发现补益气血中药八珍汤能促进创面肉芽组织成纤维细胞增殖，抑制成纤维细胞凋亡，促进大鼠难愈性溃疡创面肉芽组织生长，缩短创面愈合时间[4-5]。本实验从体外实验角度，进一步研究不同浓度八珍汤对体外培养人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响，探索中医药促进创面愈合的有效药物及其作用机制和合理浓度。为了观察八珍汤对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖的影响以及筛选合理药物浓度及最佳用药时间，采用不同浓度八珍汤对4～6 代人皮肤成纤维细胞进行干预，CCK-8 法实验结果表明八珍汤能促进人皮肤成纤维细胞增殖，在浓度为1 mg/L～1 g/L 时促进细胞增殖效果较明显，且药物干预24 h 促细胞增殖效果明显。经过CCK-8 法实验筛选，选择八珍汤作用于人皮肤成纤维细胞24h，检测低浓度（10 mg/L）、中浓度（100 mg/L）、高浓度（1 g/L）八珍汤对人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的影响。发现中浓度八珍汤(100 mg/L)能促进人皮肤成纤维细胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表达，低浓度八珍汤(10 mg/L)促进EGF、TGF-β1 表达效果并不明显，高浓度八珍汤(1 g/L)对于EGF、TGF-β1表达出现不同程度的抑制作用。

气充则可外达温煦肌肤，血足则能润泽、濡养肌肤，气血关系密切，气血能相互转化，气能生血，血能养气。成纤维细胞和毛细血管是肉芽组织的主要成分，中浓度八珍汤可能通过气血双补使皮肤得到充分温煦与濡养，在促进成纤维细胞增殖，生长因子EGF、TGF-β1、VEGFA 表达的同时，加速细胞迁移，通过激化产生血管化的因子促进血管化，加速血管新生，促进创面肉芽组织生长，最终促进创面愈合。该结果与前期的大鼠体内实验结果相吻合，证实了气血对肌肤的濡养作用。