植物棉子糖合成酶的功能及调控机理研究进展

周棋赢，张佳佳，赵 艳，胡雨桐，张瑞姣， 方志贞，李娅菲，冯迎春

(信阳师范学院 a. 生命科学学院/茶学与食品科技学院；b. 河南省茶树生物学重点实室； c. 河南省茶叶精深加工工程技术研究中心；d. 大别山农业生物资源保护与利用研究院; e. 国际教育学院，河南 信阳 464000)

0 引言

棉子糖合成酶(Raffinose synthase, RS)是催化肌醇半乳糖苷和蔗糖反应合成棉子糖的蛋白，其编码基因常以多基因家族的形式存在，在植物抵御生物和非生物胁迫中具有重要作用[1-2]。研究还发现RS基因的序列与其他棉子糖系列寡糖合成酶(Raffinose family of oligosaccharides，RFOs)基因以及碱性α-半乳糖苷酶(Alkalineα-Galactosidase，AGA)基因的序列都存在很高的相似性，因此常导致现有数据库中对RS基因的注释不准确。另外，棉子糖是植物特有的一种功能性低聚糖，是人体肠道中有益菌极好的营养源和有效的增殖因子，具有改善人体消化功能，整肠通便，促进人体对钙的吸收，增强人体免疫力，对预防疾病和抗衰老都有明显效果[3-5]。因此，开展棉子糖合成酶RS基因的鉴定和功能研究，具有重要的理论意义和应用价值。对于植物的抗性育种、品质改良、创建具有保健功能的植物种质资源都具有重要意义。本文从棉子糖及其系列寡糖的合成，棉子糖合成酶的生化和序列特征，棉子糖合成酶在种子发育与萌发中的作用，棉子糖合成酶在逆境防御中的作用，棉子糖合成酶的转录调控五个方面进行了综述，以期为植物棉子糖合成酶的鉴定及其调控机理的深入研究、利用生物工程技术进行棉子糖规模化生产及进行植物的抗逆分子育种提供参考。

1 棉子糖及系列寡糖的合成

棉子糖合成酶(Raffinose synthase, RS)是棉子糖系列寡糖(Raffinose family of oligosaccharides，RFOs)合成途径的重要组成部分，催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖的生化反应。由肌醇半乳糖苷提供半乳糖基供体合成棉子糖主要分为两个步骤：第一步是肌醇半乳糖苷的生成，由肌醇半乳糖苷合成酶催化UDP-半乳糖和肌醇反应生成肌醇半乳糖苷；第二步是由RS催化肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基与蔗糖通过α-1, 6-糖苷键进行连接，生成棉子糖[2, 6-7]。RS参与植物RFOs的合成还包括下面两个反应：在水苏糖合成酶的催化下，棉子糖接受肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基转变为水苏糖；在毛蕊花糖合成酶的催化下，水苏糖接受肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基转变为毛蕊花糖。

2 棉子糖合成酶的生化和序列特征

20世纪70年代，RS首先在蚕豆的种子中得到分离，随后在匍匐筋骨草，豌豆中都分离了RS[1]。随着分子生物学的发展，人们陆续在豌豆、黄瓜、水稻和拟南芥等植物中克隆得到了RS基因[6, 8]。研究表明，RS 为单体蛋白，纯化的RS蛋白不稳定，1 g/L的BSA和5 mmol/L DTT可以增加其稳定性；其相对分子量在 80～100 kD之间，RS的最适pH值为6.0～8.0，最适温度范围为35～45 ℃[6, 9]。在黄瓜中，RS在pH7.0、38 ℃时酶活性最高，肌醇、N-乙基马来酰、碘乙酰胺以及MnCl2、ZnCl2和NiCl2等对黄瓜RS的活性具有抑制作用[6]。豌豆RS的最适pH值为7.0，体外酶反应底物测试分析显示，豌豆RS还可以催化半乳糖基转移到D-芒柄醇(D-ononitol)和D-松醇(D-pinitol)[6]。水稻中，RS在pH7.0、45 ℃时酶活性最高，Ag2+、 Hg2+、Zn2+等会抑制其活性，但Ca2+、Cu2+、Fe2+、 Mg2+、Mn2+、Ni2+、EDTA对其活性没有影响；5 mmol/L DTT会显著提高水稻RS的活性；水稻RS不仅能利用蔗糖还能利用lactose、4-β-galactobiose、N-acetyl-D-lactosamine、trehalose 和lacto- N- biose 作为半乳糖基的受体[9]。最近的研究[10-11]发现，RS还具有水解肌醇半乳糖苷、棉子糖和p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside的酶学特征。

蛋白序列分析表明，RS都具有KXD、DDXW和RXXXD保守催化域，其中KXD中的天冬氨酸基团(D)可以作为亲核基团与糖基形成一个共价键的糖基-酶中间体, 从而完成糖基转移反应, 而RXXXD结构域中的天冬氨酸基团可以作为一个双功能的酸碱催化基团发挥作用[7, 12]。最近在玉米中的研究发现，FMXLGTEAXXLG 和 SGDPXGTXWLQGOHMVHC保守基序存在于所有RS中，对维持RS特异催化棉子糖的合成具有重要作用；而且玉米RS蛋白264位天冬氨酸(Asp)突变为丙氨酸(Ala)后，丧失了合成棉子糖的作用，但对肌醇半乳糖苷的水解活性增加近2倍[11]。大豆RS2位点中331位酪氨酸(Tyr)的插入突变或107位的错义突变(Thr突变成为IIe)，会造成大豆中蔗糖的积累，而棉子糖和水苏糖的含量减少[13]，表明这些位点对于维持RS催化棉子糖合成的活性具有重要作用。

研究[7, 14-15]发现RS基因的序列与其他RFOs合成酶基因的序列，特别是碱性α-半乳糖苷酶(Alkalineα- Galactosidase，AGA)基因的序列存在很高的序列相似性，常导致现有数据库中RS基因注释的不准确。在拟南芥基因组中注释有6个AtRS基因，但酶活鉴定和表达分析表明，AtRS2基因实际上编码一个碱性α-半乳糖苷酶，具有与RS完全不同的底物催化特异性[15-16]。AtRS5基因因为序列与碱性α-半乳糖苷酶编码基因的序列很相似，被注释为碱性α-半乳糖苷酶编码基因，但实验结果证明拟南芥AtRS5基因是一棉子糖合成酶基因，在体内催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖[14]。随后研究[17]还发现，AtRS4基因编码产物则呈现出多功能的酶学活性，不仅具有催化合成棉子糖的功能，同时还具有催化合成水苏糖以及水解水苏糖和肌醇半乳糖苷的半乳糖苷水解酶功能。生物信息学预测分析发现，玉米基因组中有10个RS基因，进一步分析表明ZmRS4、5、6、7和8编码蛋白与水苏糖合成酶具有更近的亲缘关系，为水苏糖合成酶基因；ZmRS1、2、3、9 和10为棉子糖合成酶基因[18]。但ZHAO等[19]的实验证明，ZmRS10实际上为碱性α-半乳糖苷酶编码基因。最近，该课题组在玉米中的研究发现[11]，玉米RS基因在叶片和种子中具有不同的生化特性。在种子中玉米RS催化棉子糖的合成，而在叶片中玉米RS则催化肌醇半乳糖苷的水解。异源表达豌豆中的一个RS基因，结果发现其编码一个结构和生化性质上与半乳糖苷酶相似的转糖苷酶[8]。

3 棉子糖合成酶在种子发育与萌发中的作用

RFOs是植物种子中主要的可溶性糖，在高等植物的种子中其含量能达到种子干质量的16%，在种子的成熟和萌发过程中有重要作用[18, 20]。研究表明，由RS参与合成的RFOs在种子的所有部位都有合成，它们在胚胎发育晚期就有积累，之后从种子发芽开始并在种子成熟干燥期继续积累，具有保护胚胎、延长种子寿命及提高后期种子萌发率的作用[2, 21]。在种子成熟和脱水干燥过程中，RS基因会被诱导大量表达，进而促进棉子糖快速积累；在种子萌发过程中，合成的棉子糖被α-半乳糖苷酶快速分解，进而为种子萌发提供能量和碳源[11, 20, 22]。大豆中GmRS2_A和GmRS2_B基因在种子成熟中期特异表达，对应棉子糖主要在种子发育末期积累。沉默大豆GmRS2_A基因导致种子中棉子糖和水苏糖含量的显著降低[23]。小扁豆种子发育过程中RS和水苏糖合成酶基因的表达量增加，促进了棉子糖等RFOs含量的增加[24]。拟南芥atrs4突变体中缺乏水苏糖合成，但棉子糖含量显著积累，能为种子萌发提供更多能量并增强其对环境的适应性，atrs4突变体比野生型拟南芥萌发早；拟南芥AtRS4和AtRS5双突变体的种子中完全丧失RFOs的积累，导致其萌发时间比比野生型拟南芥晚[20]。但对大豆的研究表明，由RS参与合成的RFOs在其种子萌发过程中不发挥重要作用[23]。LI等[7]的研究发现单、双子叶植物中RS在调节种子活力方面具有不同的作用机制。与拟南芥等其他植物不同，玉米中只存在一个真正催化棉子糖合成的RS基因(ZmRS)，棉子糖是玉米种子存在的唯一RFOs；zmrs玉米突变体中没有棉子糖的积累，种子活力明显降低。在拟南芥中过表达玉米肌醇半乳糖合成酶基因和ZmRS基因显著提高拟南芥种子中RFOs含量及其种子活力；过表达ZmRS基因显著增加了拟南芥种子中棉子糖的含量，但肌醇半乳糖、水苏糖和毛蕊花糖的含量降低，种子活力下降。他们的研究表明，拟南芥种子活力与RFOs总量、RFOs与蔗糖的比值有关。

4 棉子糖合成酶在逆境防御中的作用

RS在植物抵御生物和非生物胁迫中具有重要作用。RS参与催化合成的棉子糖系列寡糖(RFOs)参与了包括碳的存储与转运、信号转导、膜分选、RNA外运、维持膜的稳定性、抗冻、抗旱以及响应病原菌侵染和机械损伤等过程[2, 25]。拟南芥中超表达棉子糖系列寡糖合成酶会促进棉子糖的积累，从而会增加转基因植株对蚜虫的抗性[26]。GIL等[27]的研究发现，烟草花叶病毒侵染和高温胁迫都会诱导黄瓜中RS基因的上调表达。

拟南芥基因组中有6个RS基因, 其中AtRS2、4、6受非生物胁迫和氧化胁迫诱导表达[16, 28]。研究发现[29]，非生物胁迫(低温、干旱、高盐、氧化胁迫和热处理)都会诱导AtRS5基因的表达，AtRS5的T-DNA插入突变体中没有棉子糖的积累，抗逆性消失。超量表达AtRS5基因除了能增加拟南芥种子的萌发率，还提高了其抗旱能力[30]。在干旱胁迫条件下，AtRS4和AtRS5基因双重敲除的拟南芥植株会诱导AtRS6基因合成新的转录物，促进棉子糖的积累，增加植株的抗旱性[31]。RS通过提高种子对高温、干旱的耐受性，增强了种子的活力和贮藏能力[8, 32]。转录组研究结果也发现，干旱胁迫能诱导木本植物小桐子(JatrophacurcasL.) 中RS基因显著上调表达[33]。王智等[12]克隆了复苏植物旋蒴苣苔的RS基因(BhRFS)，进一步分析发现BhRFS的表达被干旱、低温、高盐和ABA诱导，表明BhRFS可能参与了多种非生物胁迫的抗性反应, 并受到ABA依赖的信号通路调控。乔梦等[22]在小麦中克隆了一个TaRS基因，研究表明，该基因的表达受到脱水、高温、高盐和低温胁迫处理诱导。玉米ZmRS基因在叶和胚中特异性表达，在玉米幼苗中能够被干旱、高温、高盐和冷胁迫诱导[11]。HAN等[32]在玉米中的研究发现，转录因子DREB通过调节RS的表达，增加玉米中棉子糖的积累，从而增强了玉米的抗寒性。黄瓜RS基因的表达受低温和ABA诱导，低温环境下黄瓜中RS的活性和棉子糖含量都大大增加，并引起棉子糖在细胞质，液泡和叶绿体中的积累[1, 34]。KITO等[17]在甜菜中克隆了两个棉子糖合成酶基因BvRS1和BvRS2，研究表明BvRS1受低温诱导，BvRS2受低温和盐胁迫诱导。葡萄中肌醇半乳糖苷合成酶基因和RS基因的上调表达促进了RFOs的积累，增强了其对低温的耐受性[35]。代谢组的结果也发现，棉子糖合成途径基因的表达和棉子糖等寡糖的积累，在冷驯化处理后增加葡萄的低温抗性方面具有重要作用[36]。在冷驯化过程中，茶树(Camelliasinensis)RS基因的表达会升高，说明棉子糖合成酶参与了茶树抵御寒冷胁迫的过程[37]。CUI等[8]的研究发现，棉花的共生菌黄萎病菌通过操控RS基因促进了棉子糖的积累，增强了棉花的抗盐能力。百草枯(甲基紫精)处理拟南芥会增加RS基因的表达和棉子糖的合成，增加了拟南芥对氧化损伤的抵抗能力[28-29]。SINGH等[38]研究发现，RS是一种保护性分子，可以通过调控基因表达减少活性氧对人和小鼠神经细胞中压力胁迫。

5 棉子糖合成酶的转录调控

转录因子参与信号转导、调控下游基因表达过程中，引发生物体发生一系列生理和生化反应，进而调节生物发育和环境适应性[39]。研究发现，黑暗环境下bHLH类转录因子编码基因AtPIF6在拟南芥AtRS4、 5基因双突变体中显著诱导表达，造成AtRS4、 5基因双突变体种子的萌发延迟[20]。拟南芥中，过表达热休克转录因子HsfA2会诱导AtRS2基因以及肌醇半乳糖合成酶基因AtGolS1、2 和4的大量表达，增加肌醇半乳糖苷和RS的积累，进而增加了转基因植株的抗逆能力[28]。LANG等[40]的研究也发现，在拟南芥中过表达油菜热休克转录因子BnHSFA4a促进了AtRS2基因的上调表达。实验证实，一种WRKY转录因子可以结合在RS基因的启动子区，诱导其表达进而促进棉子糖的合成[41]。在水稻中的研究发现，OsWRKY11基因的超表达提高了水稻RS基因和肌醇半乳糖苷合成酶基因的表达量，从而提高了水稻体内棉子糖的含量，增强了水稻对于干旱胁迫的耐受能力[8, 42]。GU等[43]研究结果显示，玉米原生质体细胞受到热激后热激转录因子ZmHSFA2会激活RS基因和肌醇半乳糖苷酶基因的表达，增强玉米对热胁迫的耐受性，而热休克结合蛋白ZmHSBP2对ZmHSFA2具有拮抗作用，会抑制RS基因的表达，组织细胞对热激的过度响应。玉米RS表达还受到生物钟、干旱和ABA调控，生物钟核心元件ZmPRR抑制RS基因表达，干旱胁迫和ABA处理下，转录因子ZmHB会识别和结合玉米RS基因的启动子区，解除ZmPRR对RS基因的抑制作用，促进玉米RS基因的表达[44]。玉米ZmDREB转录因子可以直接与玉米RS基因启动子区的DRE元件结合，调控RS的表达，促进棉子糖在玉米种子中的积累。ZmDREB2A与RS因启动子区的互作能延长种子保存时间、保持种子活力[45]; CBF(又名DREB1)是植物抗寒反应途径的重要调控因子[32，46]。HAN等[32]研究发现，ZmDREB1A转录因子通过与RS基因启动子区相互作用，增强了玉米对冷胁迫的耐受性。在葡萄中，GARP/MYB类型的转录因子VaAQUILO通过上调肌醇半乳糖苷合成酶基因和RS基因的表达促进了RFOs的积累，进而增强了葡萄的低温耐受性[35]。柑橘转录因子ERF108可以直接作用于RS基因启动子，促进RS基因表达和棉子糖的合成，增强了柑橘对低温的耐受性[47]。

6 展望

RS基因与其他棉子糖类寡糖合成酶基因(如水苏糖合成酶基因)以及碱性α-半乳糖苷酶基因的序列很相似，常造成数据库中RS基因注释不准确。RS不仅具有合成棉子糖的生化功能，还具有水解棉子糖、肌醇半乳糖苷和对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的水解酶活性。目前植物中对RS进行酶活鉴定的研究还很少，还需要进一步研究。

RS合成的棉子糖在维持植物种子活力和萌发方面具有重要作用，在玉米和拟南芥中相关研究显示，单、双子叶植物在维持种子活力方面具有不同的调控机制。这一机制是否具有普遍性，还需要在更多植物中开展相关研究。不同物种的RS在生化和/或功能的特异性方面可能存在差别。

甜菜中BvRS1和BvRS2基因表达受不同逆境因子诱导并具有不同的逆境响应模式，这些差异性是如何形成的，还未见报道。玉米中ZmRS在叶片和种子中通过催化不同的生化反应参与植物的抗旱性，这一过程在转录水平上是如何协调和调控的，还需要进一步研究。不同物种中调控RS基因表达的上游调控因子不同，这些差异性是如何形成的，其上游信号是如何感知和传递的，不同转录因子之间是如何互作调控基因表达的，还知之甚少。开展RS的鉴定和功能机理研究，对于延长种子资源保藏时间和植物抗逆育种，增强植物的环境适应能力都具有重要意义。