miR-199b-3p对肾癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其机制探讨

刘晨溪，赵红娟，田伟，刘超，徐洋涛，潘岩，尤校雷，周洪月

1保定市第二中心医院泌尿外科，河北保定072750；2保定市第二中心医院肿瘤科；3邯郸市中心医院泌尿外科；4河北大学附属医院泌尿外科

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～4%，其病死率较高，超过40%[1]。近年来，随着环境污染和人口老龄化，肾癌发病率逐年升高，已成为我国肿瘤相关死亡的主要原因之一。研究表明，肾癌是增殖、侵袭能力较强的恶性肿瘤，大约1/3的患者在确诊时已发生不同程度转移，不仅给临床治疗带来了困难，也是导致患者预后差的重要原因[2]。目前对于肾癌增殖、侵袭的机制仍未完全明确，研究肾癌增殖、侵袭及凋亡的机制有助于制定分子治疗策略，改善患者预后。微小RNA(miRNA)是一类长度为18～25 nt的内源性非编码小RNA分子，它可以与靶基因mRNA结合，起到参与核糖核酸代谢、降解靶基因mRNA、调控基因表达的功能，miRNA表达异常可以导致恶性肿瘤在内的多种疾病发生，并与恶性肿瘤侵袭、转移等生物学行为的发生有密切关系[3]。miR-199b-3p是近年来新发现的miRNA分子。已有研究报道，miR-199b-3p可以抑制头颈部肿瘤、肺癌、胃癌的侵袭和转移，但在肾癌中的研究鲜见报道，对miR-199b-3p的作用机制仍未完全明确[4-6]。2019年7月—2021年6月，本研究探讨了miR-199b-3p对肾癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其机制，以期为肾癌诊断、治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM培养基、RPMI1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自南京凯基生物科技发展有限公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；孔质粒、miR-199b-3p mimics、成纤维细胞生长因子2(FGF2)-siRNA质粒均购自于广州市锐博生物科技有限公司；CCK-8细胞增殖实验试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Transwell小室、Matrigel基质胶购自Corning公司；FGF2蛋白一抗、AKT蛋白一抗、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)蛋白一抗、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白一抗、磷酸化ERK(p-ERK)购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞来源及培养 人正常肾小管上皮细胞株HK-2细胞、肾癌细胞株786-O购自中科院上海细胞所。取冻存的人正常肾小管上皮细胞株HK-2细胞、肾癌细胞株786-O，将细胞迅速放入37 ℃恒温水浴锅中进行细胞复苏，1 min内将细胞全部融化，立即送入无菌室内进行操作。将HK-2、786-O细胞放入离心管中3 000 r/min离心2 min(离心半径12 cm)，用无菌生理盐水洗涤2次，再次离心，弃上清后加入无菌生理盐水吹打混匀，备用。将HK-2细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，786-O细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，分别转移至培养瓶中，将培养瓶轻轻的摇晃使细胞悬液充分混匀覆盖瓶底。在37 ℃、5% CO2、饱和湿度下进行培养，当细胞生长密度大于80%时进行细胞传代备用。

1.2.2 细胞转染及分组 取对数生长期786-O细胞铺6孔板，待细胞汇合达到60%～70%时应用Lipofectamine2000进行转染，在荧光显微镜下验证其转染效率。按照不同检测内容建立如下分组：①增殖、凋亡、侵袭能力检测。分别转染孔质粒O、miR-199b-3p mimics(10 nmol/L)建立miR-NC组和miR-199b-3p mimics组。②FGF2蛋白水平检测。分别转染孔质粒O、miR-199b-3p mimics(10 nmol/L)、miR-199b-3p mimics(50 nmol/L)，建立miR-NC组、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L组、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L组。③PI3K/AKT信号通路关键分子的检测。分别转染孔质粒O、miR-199b-3p mimics、FGF2-siRNA，建立miR-NC组、miR-199b-3p mimics组和FGF2-siRNA组。所有操作按照说明书进行，转染后将6孔板放入培养箱中培养，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养48 h后收集细胞。

1.2.3 正常肾小管上皮细胞、肾癌细胞中miR-199b-3p检测 采用RT-qPCR。取培养72 h的人正常肾小管上皮细胞株HK-2细胞、肾癌细胞株786-O，应用TRIzol法提取细胞总RNA，应用PrimeScript RT Master Mix将总RNA逆转录生成cDNA，并应用PCR法进行基因扩增。miR-199b-3p上游引物序列为5′-GRCACAGTAGTCTGCACAT-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6上游引物序列为5′-TCCGACGCCGCCATCTCTA-3′，下游引物序列为5′-TATCGCACATTAAGCCTCTA-3′。反应体系：cDNA底物1.33 μL，TaqMan2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan MicroRNA assay 1.00 μL，ddH2O 7.67 μL。将以上反应体系放入qRT-PCR仪，设定反应条件，反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40个循环。将实验重复检测3次取平均值，用2-ΔΔCt法计算miR-199b-3p相对表达量。

1.2.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取miR-NC组和miR-199b-3p mimics组细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，以100 μL/孔铺入96孔板中。接种96孔板时每组设置4个重复样本，将96孔板放入培养箱中培养，培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度。分别于细胞转染后24、48、72 h将96孔板取出，每个孔加入CCK-8试剂10 μL，轻轻敲击培养板将CCK-8试剂与培养液混匀，孵箱中孵育2 h，取出后用酶标仪检测450 nm波长处光密度(OD)值，每组取平均值。

1.2.5 细胞克隆形成能力检测 应用克隆形成实验。取miR-NC组和miR-199b-3p mimics组细胞悬液，取适量细胞接种6孔板中，每种细胞设定3个复孔，保证接种数量为2 500个/孔。37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养，每2～3天定期更换新的培养基。连续培养12 d后向每孔加入甲醇1 mL，室温条件下固定30 min，加入0.1%结晶紫溶液固定30 min。用PBS冲洗细胞3次，在室温下将6孔板晾干、拍照，在显微镜下计数每个孔细胞的数量，取平均值作为细胞克隆集落数。

1.2.6 细胞凋亡情况观察 应用Annexin V-FITC双染法细胞流式实验。取miR-NC组和miR-199b-3p mimics组细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，并用100 μL 1×binding buffer重悬细胞，并加入到1.5 mL EP管中。避光条件下加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI Staining Solution 5 μL，轻轻混匀，室温条件下反应15 min，再次加入400 μL 1×binding buffer。将配置好的细胞于1 h内应用流式细胞仪进行检测，并应用Flowjo软件分析实验结果。

1.2.7 细胞侵袭能力检测 应用Transwell侵袭实验。取miR-NC组和miR-199b-3p mimics组细胞，调整细胞密度为2×104个/mL。向每组Transwell小室上室中加入相应的细胞100 μL，下室中加入10%胎牛血清的培养基，将Transwell板放入培养箱中培养，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养48 h。取出Transwell板，应用PBS冲洗2次，加入4%甲醛固定，并用浓度为0.1%的结晶紫染色10 min后用PBS洗涤2次，室温下静置0.5 h，显微镜下观察穿过滤过膜的细胞，并计数。

1.2.8 miR-199b-3p的靶基因预测 应用生物信息学方法。在TargetScan7.1软件(http://www.targetscan.org/)搜索栏中输入miR-199b-3p，miRNA靶基因做GO功能分析，预测miR-199b-3p的靶基因，选择自由能低且功能相关的基因作为本实验检测对象，进行基因功能学分析。

1.2.9 细胞中FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白检测 应用Western blotting法。取miR-NC组、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L组、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L组细胞，提取总蛋白，电泳，选择PVDF膜转膜，封闭，滴加FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK、β-actin蛋白一抗(以β-actin为内参)，将PVDF膜TBST冲洗，避光条件下加入生物学二抗孵育1 h，应用Image Lab软件测量蛋白相对表达量。同样方法取miR-NC组、miR-199b-3p mimics组和FGF2-siRNA组细胞，检测FGF2、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 正常肾小管上皮细胞、肾癌细胞中miR-199b-3p表达比较 miR-199b-3p在肾癌细胞株786-O、人正常肾小管上皮细胞株HK-2细胞的相对表达量分别为0.48±0.12、1.00±0.03，两者相比t=9.400,P<0.01。

2.2 miR-199b-3p对肾癌细胞增殖能力的影响 CCK-8增殖实验结果显示，miR-199b-3p mimics组24、48、72 h细胞增殖能力低于miR-NC组(P均<0.05)，见表1；克隆形成实验结果显示，miR-199b-3p mimics组细胞克隆集落为(34±5)个，低于miR-NC组的(126±8)个(t=16.891,P<0.01)。

表1 各组细胞OD450比较

2.3 miR-199b-3p对肾癌细胞凋亡情况的影响 miR-199b-3p mimics组细胞凋亡率[(31.4±2.9)%]高于miR-NC组[(24.8±2.4)%](t=3.037,P=0.039)。

2.4 miR-199b-3p对肾癌细胞侵袭能力的影响 miR-199b-3p mimics组细胞侵袭能力[(39±8)个/区域]低于miR-NC组[(62±12)个/区域](t=3.906,P=0.003)。

2.5 miR-199b-3p对肾癌细胞中FGF2表达的抑制 TargetScan7.2软件在线预测显示，FGF2 3′非编码区与miR-199b-3p具有结合位点，见图1。Western boltting法实验结果显示，miR-NC组、miR-199b-3p mimics 10 nmol/L组、miR-199b-3p mimics 50 nmol/L组FGF2蛋白表达分别为0.87±0.11、0.42±0.06、0.23±0.04，转染miR-199b-3p后FGF2蛋白表达降低(F=12.365,P<0.01)，三组两两比较P均<0.05。

图1 TargetScan7.2软件在线预测结果

2.6 miR-199b-3p对肾癌细胞中FGF2及PI3K/AKT信号通路关键分子表达的调控 miR-199b-3p mimics组、FGF2-siRNA组细胞中FGF2、p-AKT、p-ERK蛋白表达低于miR-NC组，AKT、ERK蛋白高于miR-NC组(P均<0.05)，见表2。

表2 各组FGF2、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白表达比较

3 讨论

据统计，肾癌发病率仅次于膀胱癌，是泌尿系统第二大恶性肿瘤[7]。肾癌组织学类型包括透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞癌、未分化癌等，其中透明细胞癌占肾癌的70%～80%，是最常见的组织学类型[8]。目前手术仍然是临床上治疗肾癌的主要方法，但由于肾癌早期易发生侵袭和转移，使患者丧失了手术根治的机会[9]。据统计，约有1/3的肾癌患者在初次诊断时已经发生转移，加之肾癌对放疗、化疗不敏感，大部分患者预后较差，中位生存期不足2年，5年生存率低于10%[10]。恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移是一个错综复杂的过程，涉及多种基因、蛋白和细胞因子的相互作用[11]。从分子生物学方面对肾癌细胞增殖、侵袭等过程进行深入研究，有利于早期发现肿瘤，并进行针对性的干预，明确预后。

miRNA是一类广泛存在于各类动植物细胞中的非编码小RNA分子，目前在人类中已鉴定的miRNA超过200种，这些miRNA在组织发育、细胞增殖、细胞凋亡、组织代谢、细胞分化等方面发挥着重要的作用[12-14]。机体中的各种miRNA与基因形成了复杂的调控网络，参与机体生理和病理过程[15]。miR-199是具有抑癌作用的miRNA分子[16]，其成员包括miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p等。已有报道显示，miR-199家族在肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌等发挥抑癌作用，可以抑制肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌的发生和发展[17-19]。miR-199b-3p是miR-199家族的重要成员之一[20]。研究表明，miR-199b-3p可以通过靶向磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon抑制前列腺癌的恶性增殖和侵袭[21]。

目前，miR-199b-3p在肾癌中的作用还未知。本研究结果显示，在786-O细胞中miR-199b-3p呈异常低表达，提示在肾癌发生、发展中miR-199b-3p可能扮演“抑癌基因”的角色。为了进一步验证miR-199b-3p在肾癌发生、发展中的作用，本研究分别向786-O细胞转染了空质粒O和miR-199b-3p mimics，并应用CCK-8增殖实验和克隆形成实验检验各组细胞增殖能力，结果显示miR-199b-3p mimics组细胞增殖能力低于miR-NC组，证实miR-199b-3p可以抑制786-O细胞的增殖。同时，细胞流式实验结果显示，miR-199b-3p mimics组细胞凋亡高于miR-NC组。众所周知，细胞增殖能力升高和凋亡能力降低可导致细胞恶变，并促进肿瘤细胞的不断演进。提示，对miR-199b-3p进行调控，提高miR-199b-3p的表达可抑制肾癌的发生，并为肾癌精准治疗提供新的策略和研究方向。

侵袭是恶性肿瘤的重要生物学特征，而肾癌也是一种侵袭能力较强的恶性肿瘤。本研究结果表明，转染miR-199b-3p mimics后786-O细胞侵袭能力降低，分析miR-199b-3p可以通过抑制某些侵袭相关基因，导致786-O细胞侵袭能力降低。既往有研究报道，miR-199b-3p还可以通过抑制ITGA3抑制头颈部肿瘤的侵袭和转移[22]。

要了解miRNA功能的最佳途径之一就是阐明其靶点[23]，本研究应用生物信息学的方法筛选了miR-199b-3p可能作用的靶点，结果显示FGF2 3′非编码区与miR-199b-3p具有结合位点，但有结合位点是否有调控功能需要进一步验证。为了进一步验证结合位点是否有功能，本研究向786-O细胞中分别转染孔质粒、及不同剂量的miR-199b-3p mimics(10、50 nmol/L)，Western blotting法结果显示，转染miR-199b-3p后FGF2蛋白表达降低，转染miR-199b-3p mimics剂量越高，FGF2蛋白表达降低越明显，表明miR-199b-3p mimics可以调控FGF2蛋白，导致FGF2蛋白表达降低。这一结果证实miR-199b-3p与FGF2具有靶向调控关系，结合生物信息学预测结果，可以推断miR-199b-3p可以通过与FGF2 3′非编码区结合导致FGF2表达降低。FGF2是由多种细胞产生的细胞生长因子，它可以促进内皮细胞迁移和平滑肌细胞增殖，在组织修复、血管形成等方面发挥重要作用[24]。最近研究表明，FGF2可以促进肿瘤细胞增殖和侵袭[25]。SHI等[26]报道，FGF2可以通过影响PI3K/AKT信号通路促进食管癌增殖和侵袭。XU等[27]报道，FGF2可以经PI3K/AKT信号通路促进鼻咽癌的发生。AKT、ERK是PI3K/AKT信号通路的关键分子，当AKT、ERK发生磷酸化时可以激活PI3K/AKT信号通路，并促进细胞的增殖及血管生成，抑制细胞凋亡[28]。本研究中，miR-199b-3p mimics组、FGF2-siRNA组细胞中FGF2、p-AKT、p-ERK蛋白表达低于miR-NC组，AKT、ERK蛋白表达高于miR-NC组，表明miR-199b-3p可以使AKT、ERK磷酸化水平降低，进而抑制AKT、ERK激活。但由于条件限制，本研究没有进行双荧光素酶实验对miR-199b-3p的靶点进行验证，其深入的分子机制后续需要进一步研究验证。

综上所述，miR-199b-3p在肾癌细胞中低表达，可以抑制肾癌细胞增殖、侵袭，促进其凋亡，其作用机制可能与miR-199b-3p负靶向调控FGF2、PI3K/AKT信号通路有关。