纳米技术抗耐药菌的研究进展

洪 冕，黄佳敏，陈冬梅,2，谢书宇*

(1.华中农业大学国家兽药残留基准实验室(HZAU)，武汉 430070；2.华中农业大学国家兽药安全评价实验室(HZAU)，武汉 430070)

细菌感染对动物健康造成了严重威胁，抗生素因具有高效抗菌特性而成为细菌性疾病治疗的首选方案。自1928年亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，诸多抗生素被发现并用于细菌性疾病治疗。20世纪30—60年代被称为抗生素“黄金时代”，这个时期涌现出大批抗生素，但在之后几十年新发现的抗生素种类大幅减少[1]。同时，由于抗生素的过度使用，耐药细菌不断出现，这使得细菌性疾病的发病率及死亡率不断攀升。治疗成本的增加和畜禽生产力的下降，给养殖业造成了高额经济损失。2015年，世界卫生组织(WHO)宣布将抗微生物药物耐药性(AMR)列为全球十大健康威胁之一[2]。

纳米技术，即对纳米材料的研究及运用。纳米材料具有独特的物理、化学和生物特性，可通过破坏细胞壁及细胞膜、抑制外排泵、抑制灭活酶以及阻碍生物被膜形成等机制来对抗耐药细菌，提高抗菌药物疗效。将纳米技术运用于抗菌药物研发，可为对抗耐药菌提供新途径。本文将对纳米技术的发展历程、对抗耐药细菌策略以及对抗耐药性的机制进行总结，希望能为解决细菌耐药性问题提供有效应对方案。

1 纳米技术发展历程

1959年，现代纳米技术之父Richard Feynman在加州理工学院举办的美国物理学会年会上进行了名为“物质底层大有空间”的演讲，并描述出一个利用微型元件构建分子水平仪器的愿景[3]。这是对纳米概念的首次引入。1981年，扫描隧道显微镜(STM)的发明使得人们第一次观察并操纵单个原子，这为促进纳米领域研究发展提供了可视化的直接证据[4]。随后，原子力显微镜(AFM)、扫描探针显微镜(SPM)等仪器的相继发明更是推动纳米观测及加工研究的不断深入。

“纳米医学”概念源于纳米技术与医学的融合。纳米材料具有小尺度、电化学等性质并易于表面修饰，可通过改变溶解度、提高靶向性、缓释、控释等方式提高药物治疗效果。而随着耐药菌的不断出现，纳米材料也开始被广泛应用于细菌性疾病的治疗。最开始，人们将抗生素装载于纳米载药系统中以提高其抗菌效果，常见纳米载药系统包括固体脂质纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒、金属纳米粒、胶束聚合物、树状大分子、囊泡和量子点等[5]。然而，随着越来越多抗菌纳米材料被发现，利用纳米材料制备不含抗生素的抗菌剂成为热点。

1980年，Boman等第一次发现抗菌肽(AMP)天蚕素。AMP既可与纳米载体结合，也可通过自组装形成有序纳米结构，其由于独特抗菌机制、广谱抗菌活性、低药物残留以及易于合成与修饰而有望作为抗生素替代品[6]。在1985—2004年，研究人员又陆续发现了3种新型碳纳米材料——碳纳米管、石墨烯、富勒烯及其相关的纳米复合材料亦展现出了强大的抗菌性能[7]。而作为纳米材料的重要分支，金属纳米材料也可直接作为抗菌剂使用，其抗菌性能多取决于大小、形状及组成[8]。迄今为止，已有金、银、铜、硫化铜、氧化铁(III)、氧化锌、氧化镁、氧化铜、氧化钙、二氧化钛和氧化镉等金属或含金属的纳米材料被证明具有高效抗菌活性[9]。

2 纳米技术对抗细菌耐药性的策略

2.1 负载抗菌药物

以纳米材料作为载体，可在保护药物不被降解的同时促进药物进入细菌。这增强了药物与细菌间的相互作用，亦减少了药物用量，规避耐药细菌产生。例如，将替考拉宁装载于接枝金黄色葡萄球菌特异性配体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒内，其对耐替考拉宁金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)降低98%[10]。载有万古霉素的纳米囊泡因高比表面积而能更好分布和吸附至细菌表面，并可高效清除细菌生物被膜，其持续抗菌时间远超万古霉素，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的MIC亦比万古霉素低94%[11]。

2.2 自身直接抗菌

部分纳米材料自身便具备较强的抗菌能力，可代替抗菌药物用于治疗耐药细菌的感染。例如，4,6-二氨基-2-嘧啶硫醇修饰的金纳米粒(AuNPs)可抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌中多重耐药菌株的增殖，其既可以选择性螯合细胞膜上Mg2+以破坏膜结构并泄漏胞内物质，又可以同核糖体和染色体结合以干扰DNA复制、转录以及蛋白质合成[12]。Gurunathan等[13]制备的银纳米(AgNPs)通过增强氧化应激反应并抑制抗氧化水平来对抗多重耐药细菌，其对产黑色素假单胞菌、化脓性假单胞菌的MIC仅为0.8和1.0 μg·mL-1，而对生物被膜的抑制活性高达90%以上。

2.3 光介导抗菌

2.3.1 光热抗菌 具有光敏活性的纳米材料能吸收近红外光(NIR)并转换为热量，其可导致细胞膜破裂、蛋白质变性以及细菌消融[14]。例如，表面修饰有苯硼酸糖聚合物的硫化铜纳米粒在NIR照射下产生高热，高温抑制了细菌酶活性、细胞膜通透性以及蛋白质和核酸的合成[15]。试验结果表明，其对耐药铜绿假单胞菌的抗菌效率超过82%，同时可清除85%以上的生物被膜[15]。Yang等[16]将具有光热特性的聚吡咯整合至阴离子囊泡上，该种纳米材料在NIR照射10 min后可使小鼠组织温度升高近20 ℃。体外试验证明，其在NIR照射下显著提升对鼠伤寒沙门菌耐药菌株的生长抑制效果并有效阻止生物被膜的形成[16]。

2.3.2 光动力抗菌 光动力抗菌疗法是通过纳米材料实现无载药抗菌的另一种策略。其机理多基于光敏剂的光化学反应，即光照条件诱导纳米制剂生成大量ROS，进而损害细菌细胞膜、蛋白质以及胞内DNA[17]。例如，结合有二氢卟吩e6的纳米粒在光照下产生大量ROS，可清除95%的耐药铜绿假单胞菌及其70%的生物被膜[18]。有机磷光纳米粒能与基态氧进行有效能量转移，因此具备快速生产单线态氧的能力，其在光照5 min后便可杀死100%的MRSA[19]。

2.4 纳米酶辅助杀伤

纳米酶具备氧化酶、过氧化物酶和脱氧核糖核酸酶等天然酶性质，可促进氧化应激反应，导致细菌损伤[17]。多孔AgPd双金属合金纳米笼具有氧化酶活性，可通过催化生成ROS来杀伤细菌，其对细菌的MIC在诱导传代12次以后并未增加，而将其用作表面涂层添加剂时亦可有效抑制生物被膜形成[20]。pH响应性发光纳米酶则是兼具氧化酶和过氧化物酶双重活性，酸性条件下，其酶活性被激活以催化生成ROS，在pH=5.5的环境中可抑制99.2%的大肠杆菌、96.5%的金黄色葡萄球菌以及98.4%的MRSA生长[21]。

3 纳米技术对抗耐药细菌机制

3.1 损伤细胞壁及细胞膜

耐药菌通过降低细胞膜通透性限制抗生素进入。由于细菌表面携带的负电荷要多于机体细胞，因此带正电荷的纳米材料可优先同细菌大量结合，进而影响细胞壁和细胞膜结构，导致胞内容物流失[22]。例如，质子化伯胺修饰的低分子量聚合物通过自组装形成具有高正电荷密度的有机纳米粒，其导致耐氨苄西林大肠杆菌表面呈现破碎、倒塌及残缺状态[23]。由两种季铵盐前体合成左氧氟沙星碳点可吸附于细菌表面并诱导细胞膜穿孔、破裂，其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC在耐药诱导38代时仍未发生改变，而盐酸左氧氟沙星对这两种菌的MIC分别在耐药诱导10代和16代后增加[24]。

3.2 抑制外排泵

耐药细菌中外排泵表达通常会上调，以便主动将抗菌药物转送至细菌外[22]。而纳米材料可与细菌大量结合，其在目标部位的高浓度能抑制外排泵的主动清除作用。例如，将四环素和盐酸林可霉素封装于聚丙烯酸纳米凝胶载体中，用阳离子聚电解质进行功能化修饰后可实现其在细胞壁上的累积并局部释放药物，其对四环素以及林可霉素高度耐药菌的MIC比游离抗生素低87.5%[25]。多元醇包被的CuO、ZnO和CuZn纳米粒可用作外排泵抑制剂，与抗生素联用时表现出较好的协同抗菌作用。细菌外排试验表明，其抑制了76.7%的溴化乙锭流出多重耐药铜绿假单胞菌[26]。

3.3 抑制灭活酶

通过产生灭活酶来水解或修饰抗菌药物是另一种细菌耐药机制，常见灭活酶包括β-内酰胺酶、酯酶、氨基糖苷钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、核苷转移酶等[27]。如今，酶促失活已成为新一代抗生素类药物实际应用主要难题。某些纳米材料恰好可抑制灭活酶活性，从而保护抗菌药物。例如，多功能金属螯合膦酸盐/FeO磁性纳米粒能抑制66%的β-内酰胺酶活性，用其负载头孢氨苄后可将头孢氨苄的MIC降低75%[28]。一种由苯并恶唑和葡聚糖构成的纳米制剂对β-内酰胺酶的抑制率可达77.5%，当其负载头孢西丁钠(CFS)时对耐CFS大肠杆菌的MIC仅为游离CFS的6.2%，可更快治愈耐药细菌感染伤口[29]。

3.4 多重靶标

细菌上通常存在可被抗菌药物识别的特定靶标，耐药基因的表达可导致靶标数量减少或被化学修饰，从而干扰细菌与药物结合，赋予细菌耐药性。纳米材料可识别并结合多个靶标，因此其诱导耐药菌出现的可能性小，并且面对部分靶标突变时亦能发挥较强抗菌作用。例如，氢氧化镧与氧化石墨烯构成的纳米复合材料(La@GO)具有磷脂去磷酸化、脂质过氧化和肽聚糖破坏等胞外多重靶标杀伤机制。当大肠杆菌连续30 d暴露于亚MIC浓度的La@GO中时并不会出现继发性耐药，而诺氟沙星则导致细菌的耐药性增加了64倍[30]。银可通过靶向糖酵解、氧化磷酸戊糖途径、氧化应激等多个基本通路杀死金黄色葡萄球菌。Wang等[31]将金黄色葡萄球菌连续暴露于AgNPs 16次未能诱导MIC增加，并且AgNPs可与多种抗生素产生协同抗菌作用，这意味着其能使耐药细菌对抗生素重新敏感。

3.5 产生活性氧(ROS)

ROS是细胞氧化代谢副产物，包括超氧阴离子(O2-)、单态氧(1O2)、过氧化物(O22-)等，它们影响着细胞的分化、信号传导、存活以及死亡。纳米材料可自身产生ROS、诱导细胞器产生ROS以及同具有氧化还原活性的生物分子(如NADPH氧化酶)作用以氧化生成ROS[22]。由于细菌耐药机制并未针对ROS，因此过量ROS对耐药细菌仍能产生较好的抗菌作用。ROS一方面与蛋白质硫醇反应，使游离蛋白质及细胞壁受体失活；另一方面可氧化dCTP和dGTP池导致DNA双链断裂，使碱基误入DNA，造成DNA损伤[22,32]。此外，ROS还可预防生物被膜形成并破坏已建立的生物被膜[33]。二硫化钼纳米片是一种光催化剂，其在太阳光照射下可产生大量ROS以杀死99.9%的耐药细菌[34]。CuInS/ZnS量子点通过吸收NIR以产生ROS，其在光照10 min后可杀死82%的耐药铜绿假单胞菌，并有效抑制生物被膜形成[35]。

3.6 损伤细胞成分

除生成ROS以外，纳米材料还可直接损伤蛋白质、DNA等胞内成分，进而干扰耐药细菌同质状态、胞内信号通路以及细胞代谢。其常见损伤机制包括改变细菌基因表达、造成DNA损伤以及干扰蛋白质合成[22]。血小板膜伪装纳米粒可减弱MRSA内部F型ATP合酶活性，ATP水平的降低使得细菌因代谢能量不足而死亡，其负载万古霉素后对MRSA的MIC是万古霉素的1/4[36]。花状AgNPs可中断细菌ATP合成并诱导三羧酸循环等代谢途径失调，研究表明，其增强了耐药大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性，使诺氟沙星治疗剂量降低90%[37]。

3.7 对抗细菌生物被膜

基于适应性和自然耐受性，细菌从自由生活的生命形式(即浮游生物)转变为固着的多层次群落(即生物被膜)[38]。多糖、蛋白质、脂质以及胞外DNA等胞外聚合物构成生物被膜基质，可隔离或延缓吸收抗菌药物[39]。同时，生物被膜中的“休眠细胞”代谢活性低、生长速度慢，因此对抗菌药物存在一定抗性[38]。此外，生物被膜由于内部结构稳定性和细菌紧密邻近性而成为水平基因转移的理想生态位，膜内各细菌之间相交换耐药基因，促进耐药细菌产生[40]。多物种生物被膜的形成将导致抗菌药物最低生物被膜杀菌浓度(MBBC)增加。纳米材料可增加抗菌药物在生物被膜上的渗透性，也可借助光热转换等物理或生化作用破坏生物被膜完整性[41]。例如，Makabenta等[42]制备的聚合物纳米粒可有效穿越生物被膜，其对双物种生物被膜的MBBC无显著增加，同时以剂量依赖性方式根除细菌并减少生物被膜生物量。He等[43]制备的高效光热纳米粒具有较强光热转化能力，在光照条件下可使生物被膜基质中的蛋白质、多糖等黏性成分失活，体外试验表明其可根除75%的金黄色葡萄球菌生物被膜。

4 小 结

通过改变细胞膜通透性、表达灭活酶以及形成生物被膜等方式，细菌对抗菌药物的抵抗力不断增强。耐药细菌的出现降低了传统药物小分子的临床治疗效果，而加大治疗剂量又可能导致机体损伤与药物残留。因此，寻找新方法以对抗细菌耐药性显得尤为迫切。纳米材料通过破坏细胞壁及细胞膜、抑制外排泵、抑制灭活酶等多种方式来对抗耐药细菌。其具备广阔设计空间，不仅粒径、电位、形态可调，还能进行多种表面修饰。目前，利用纳米材料制备抗菌剂已成为热门。随着纳米技术的发展，具有多重抗菌机制的多功能复合纳米不断开发，将在抵抗细菌耐药性领域具有更广阔的发展前景。不过，尽管抗菌性能优异，纳米材料在临床应用方面仍存在诸多挑战。首先，多数抗菌纳米材料通过静电相互作用与表面带负电荷的细胞结合，难以特异性区分细菌与机体细胞。人们需寻找能与细菌结合的特异性配体，以增强纳米材料对细菌的靶向识别与结合能力。其次，对机体的潜在毒性是纳米材料临床应用的主要难题之一。一些纳米材料可刺激树突状细胞以及其他免疫细胞释放活性氧等介质，从而诱导机体产生超敏反应、自身免疫性疾病和炎症反应[44]。因此，在确保纳米制剂具有良好杀菌作用的同时也必须对其进行细胞毒性评估，并通过改变大小、形状、表面电荷、制备方法以及表面修饰等方式来降低毒性作用。相信随着纳米技术的不断拓宽与深入研究，其在对抗耐药细菌方面的应用必将得到进一步发展。