牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

秦义娴，刘 丹，陈晓春，薛青红，吴华伟，高月异，高金源

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以高热、腹泻、怀孕母牛流产或胎儿畸形、口腔和消化道黏膜糜烂、坏死及血小板和白细胞减少为主要特征的接触性传染病[1]。BVDV的自然宿主是牛，感染怀孕牛后，可导致持续性感染(persistent infection，PI)牛犊的出生，PI牛在整个生存周期持续排出大量感染性病毒颗粒，是易感动物感染病毒的主要来源。目前BVD呈全球性分布，给各国的养牛业造成了严重的经济损失，急性感染的病牛导致的损失达每头牛46.5美元[2]。

BVDV包括BVDV-1、BVDV-2两种基因型，每种基因型都包括致细胞病变型(cytopathic，CP)和非致细胞病变型(non-cytopathic,NCP)两种生物型。根据5’-UTR、Npro和E2基因序列的差异，将BVDV-1分为至少22个基因亚型，将BVDV-2分为4个基因亚型。BVDV在我国各个省份均有流行，且流行形势较为复杂，新疆、云南等地部分牛场的BVDV阳性率达60%以上[3-4]。有些地区牛群中甚至同时流行多种亚型[5]。当前，BVDV的防控主要依靠疫苗免疫及清除PI牛，而如何准确对BVDV感染牛及PI牛进行鉴别诊断显得尤为重要。本文综述了国内外BVDV检测方法的研究进展，以期为BVD的防控和净化提供参考。

1 病原学诊断

1.1 病毒的分离鉴定

各种牛源细胞均可用于BVDV的分离培养，目前最常用的是传代牛肾(MDBK)细胞。将病毒分离材料，如牛血清样本、分泌物、排泄物等经过处理后接种MDBK细胞，如是致细胞病变型毒株，可在接种细胞后的最初几代内出现皱缩、变圆、拉网、脱落，聚集后产生合胞体和巨细胞等现象即可初步确定为BVDV。而非致细胞病变型毒株，则需盲传3代～5代，最终结合免疫荧光等方法确定病毒分离成功。BVDV的分离鉴定是最基础的检测BVDV的技术，是鉴别BVDV感染的“金标准”，该项技术不需要特殊的仪器设备，仅进行细胞培养即可。但该方法操作周期较长，不能满足BVDV快速检测的需求，且不适用于大量样本的检测。此外，该项技术对细胞、血清的要求较高，特别是近些年作为细胞分离培养原材料之一的胎牛血清中BVDV污染较为严重，较大程度限制了该方法的使用。目前有研究人员使用异源血清进行分离培养[6]。

1.2 电镜检查

电镜检查是观察BVDV颗粒的经典方法，常用的有直接电镜技术和免疫电镜技术。直接电镜技术对BVDV样本的量要求较高(约107个/mL)，观察到的BVDV颗粒通常是散在的，但可观察到病毒粒子的自然形态。李祯等[6]在透射电镜下观察到直径为40 nm～60nm的球形、外被囊膜的BVDV颗粒。而免疫电镜技术通常可见到大量的BVDV颗粒聚集在一起。王冶才等[7]利用免疫电镜技术，观察到大小不等的BVDV粒子。相较于直接电镜技术，免疫电镜技术敏感性更好，且可更快速地观察到病毒粒子。近些年又发展出检测BVDV的蛋白A胶体金免疫电镜技术，相较于传统的直接电镜技术和免疫电镜技术，该技术敏感性更高，更快速。但不管是哪种电镜技术，均需专业人员使用专业的仪器设备进行操作，检测成本较高，且检测时间较长，仅适用于初筛为BVDV阳性样本的确认，该方法只能用于BVDV的实验室检测，无法推广到基层。

2 血清学方法

2.1 血清中和试验

血清中和试验是对BVDV或抗体进行定性或定量分析的一种方法，在实际操作中，可对疑似感染牛间隔3周～4周前后采血2次，测定血清的中和抗体效价，如果第2次高于第1次4个滴度以上可判为阳性，2个滴度以上，视为疑似患病。该方法敏感性高、特异性好、可重复性强，是世界动物卫生组织(WOAH)推荐的检测BVDV抗体的标准方法之一，广泛用于BVDV的血清学调查。但在检测抗体时，因BVDV不同基因型及基因亚型的抗原性存在差异，抗原的选择会对抗体滴度的精确定量存在影响[8]，且由于持续性感染牛对病毒缺乏免疫应答而不产生抗体，在进行血清中和试验时会因为阴性结果而造成误判。此外，该方法操作较为繁琐，周期长，费时费力，目前仅用于BVDV的实验室检测。

2.2 酶联免疫吸附试验

目前检测BVDV的常用酶联免疫吸附试验(ELISA)包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、阻断ELISA、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)、葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)、单层酶联免疫吸附试验(M-ELISA)及细胞内酶联免疫吸附试验(In Cell-ELISA)等。

2.2.1 间接酶联免疫吸附试验 间接酶联免疫吸附试验是检测BVDV抗体的常用方法，可用于检测样品中BVDV总抗体的浓度。但采用全病毒作为包被抗原需对BVDV大量增殖后进行浓缩和纯化，难度较高。为弥补这一缺点，可采用重组蛋白作为包被抗原，其中结构蛋白Erns和E2及非结构蛋白p80因免疫原性较强，常作为包被抗原。陈瑞红[9]将3种蛋白分别进行原核表达并建立ELISA方法，通过比较，认为重组蛋白E2作为包被抗原建立的间接ELISA方法更为特异。

2.2.2 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 捕获抗体和检测抗体一般由不同种属的动物制备，如应用单克隆抗体，一般选择2个针对BVDV不同抗原决定簇的单克隆抗体。胡俊英等[10]制备了抗BVDV E2蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，并以此建立了基于单克隆抗体捕获BVDV抗原的双抗体夹心ELISA方法，动物感染病毒后可通过检测其粪便排泄物的BVDV抗原作出早期诊断。丁金华[11]与周子恒[12]分别利用纳米抗体和多克隆抗体建立基于抗BVDV纳米抗体双抗体夹心ELISA检测方法，用于检测BVDV，虽然方法在敏感性方面存在问题，检测效果不理想，但将纳米抗体引入ELISA方法的建立过程，仍为BVDV检测方法的改进提供了新思路。

2.2.3 阻断酶联免疫吸附试验 阻断酶联免疫吸附试验也称竞争ELISA，当待检样品无法提纯或不能进行稀释时，可用此法检测BVDV特异性抗体。王新平等[13]建立了双抗体夹心阻断ELISA方法，并对长春地区293头奶牛和262头黄牛的血清样品进行测定，结果显示,黄牛抗体阳性率高达43.5%。但阻断ELISA的缺点是操作较为繁琐，用时较长。

2.2.4 斑点酶联免疫吸附试验 斑点酶联免疫吸附试验是一种经济、快捷，可肉眼直接判定的ELISA方法，适合BVDV的临床诊断及抗体监测。Zhao Y L等[14]建立了检测BVDV抗体的间接Dot-ELISA，与Idexx ELISA试剂盒相比，该方法的特异性、敏感性和准确性分别为96.7%、92.5%和95%。

2.2.5 葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验 葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验是利用辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白代替酶标二抗建立的ELISA方法，其优点是可用于多种哺乳动物抗体的检测。柴顺秀等[15]利用BVDV重组E2蛋白建立了检测BVDV血清抗体的E2-PPA-ELISA方法，结果显示与Idexx ELISA试剂盒的检出率无显著差异。

2.2.6 单层酶联免疫吸附试验及In Cell酶联免疫吸附试验 单层酶联免疫吸附试验是将细胞培养与ELISA结合的检测技术。研究人员通过比较发现，检测BVDV时，M-ELISA与病毒分离试验敏感性无显著性差异，但比免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)方法更快速，且更客观。In Cell-ELISA是一种用于检测和分析BVDV感染的新方法，将BVDV的传染性标准化为培养细胞的数量，可用于CP和NCP毒株的检测[16]。ELISA方法是目前检测BVDV应用最广泛的方法之一，与经典的病毒分离等方法相比，该方法可同时对批量样本进行检测，且对仪器设备和试验人员的要求较低。但利用ELISA方法进行BVDV抗体检测时，容易受到母源抗体的干扰，且与同属的猪瘟病毒(Classical swine fever viru，CSFV)之间存在交叉反应，也不能对PI牛进行筛选。

2.3 免疫荧光技术

检测BVDV常用的方法有直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术。直接免疫荧光技术即将荧光素标记在抗体上，直接与BVDV抗原发生反应。优点是简便快捷，特异性高，非特异性染色少，缺点是敏感性低，且标记的抗体需达到一定浓度，否则荧光太弱，影响结果的观察。此外，有研究表明BVDV基因型及抗原差异对直接免疫荧光试验影响较大[17]。间接免疫荧光方法较直接免疫荧光方法敏感性提高，该方法与血清中和试验、病毒分离试验的结果高度相关，且敏感性高于抗原捕获ELISA，更适合用于血清中BVDV抗原的检测[18-20]，但其缺点是容易产生非特异性荧光。不管是直接方法还是间接方法，都需要使用荧光显微镜，对仪器设备的要求较高，一般仅用于BVDV的实验室检测，无法用于基层检验。

2.4 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验灵敏度不高，与微量中和试验的阳性率之间差异极显著(P<0.01)[21]，且仅能检测出BVDV群特异性抗体，与CSFV存在交叉反应。不能用于BVD的精确诊断，尽管如此，因琼脂扩散试验操作简便，无需特殊的设备或试剂，可用于大量血清样本的检测，常作为基层BVDV检测的初筛方法。

3 分子生物学方法

3.1 核酸扩增

3.1.1 RT-PCR 目前已广泛用于BVDV的鉴定、分型及遗传进化分析，对CP型和NCP型毒株均可检测，该方法特异性高、敏感性强、检测周期短，能批量检测临床样本，且多次检测时可筛选出群体中的持续性感染动物[22]，对于BVDV的防控具有重要意义。随后，在普通PCR的基础上，研究人员又建立了套式RT-PCR及可同时检测BVDV与常见牛腹泻疾病的双重或多重RT-PCR方法，检测灵敏度高于普通PCR[23]，且大大提高了检测效率，降低了检测成本。但普通RT-PCR只能定性分析，需通过琼脂糖凝胶电泳判定结果，在操作过程中常因气溶胶污染出现假阳性，且存在非特异性条带时容易产生误判。因此，在操作时应严格设置阴阳性对照，保障结果的准确性。虽然该方法应用广泛，但因需要PCR仪，尚无法推广到基层进行使用。

3.1.2 荧光定量RT-PCR 在普通RT-PCR基础上，研究人员建立了检测BVDV的荧光定量RT-PCR方法，敏感性显著高于RT-PCR[24]，且能定量分析待检样品。加入反应体系后不必打开反应管，一定程度上避免了气溶胶污染。但该方法需要荧光定量PCR仪，仪器的使用和维护成本较高，试剂和耗材也高于普通PCR仪，仅可用于BVDV的实验室检测。

3.1.3 RT-LAMP 近年来，随着环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的发展，研究人员建立了可用于BVDV检测的RT-LAMP检测方法，该方法虽然与病毒分离方法的阳性率差异较大，但与Idexx抗原捕获ELISA方法的阳性率无明显差异[25]，且从试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度及检测成本等方面均优于荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR[26]，更适合用于基层BVDV的快速检测。范晴等[27]在RT-LAMP的基础上，在LAMP引物中标记荧光基团，建立了二重荧光RT-LAMP，反应后通过扩增产物的颜色读取反应结果，可准确鉴别检测BVDV和牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)两种病毒，解决了国内多重LAMP方法不能准确检测是哪种病原而引起阳性结果的问题。

3.1.4 纳米PCR 纳米PCR是一种新型的PCR技术，敏感性高于常规PCR，可用于BVDV的快速检测。刘泽余等[28]利用该技术对吉林省部分省界地区的血清样品及临床组织病料进行检测，共检测出150份阳性血清样品，BVDV阳性率为19.21%。

3.1.5 重组聚合酶扩增-侧向试纸条检测 该技术简称为RPA-LFD。重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)被认为是可以替代PCR的核酸检测技术，侯佩莉等[29]针对BVDV 5’UTR序列，建立了一种BVDV RPA-LFD检测方法，检测限达2TCID50，与WOAH推荐的实时荧光PCR方法检测限一致。

3.2 核酸探针杂交技术

3.2.1 核酸探针杂交技术 广泛应用于病毒或细菌的基因检测。根据标记物的不同，一般将核酸探针分为两类：一类是放射性同位素标记探针(如32P等)，一类是非放射性物质标记核酸探针(如生物素、地高辛等)。因放射性同位素具有放射危害且半衰期短、不稳定，目前BVDV的检测常用的是非放射性物质标记核酸探针。杂交试验可以检测CP型和NCP型毒株，且敏感性比BVDV感染试验强10倍～100倍[30]。值得注意的是，针对BVDV基因组不同区域的探针，检测率存在差异，针对5’末端的探针检出率高于其他区域[31-32]。随着纳米技术的发展，Heidari Z等[33]建立了交联与非交联金纳米杂交试验，可直接检测BVDV，无需扩增，检测灵敏度可达每反应6.83 ng和44.36 ng，两种方法成本低廉，操作简单，可用于BVDV临床样本的检测。核酸探针杂交技术操作简便、特异性高、敏感性强，结果准确，可在同一张膜上进行几个甚至上百个样品的检测，可用于BVDV大量样本的快速检测，但单个样品的检测成本较高。

3.2.2 基因芯片技术 基因芯片技术是分子杂交技术的发展，与传统的核酸分子杂交技术相比，该方法可实现样品的高通量检测，并能同时检测多种病原，由于该方法的反应体积小，大大降低了检测成本，能用于BVDV大规模的检测筛选。随后，高峰等[34]将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合，可同时检测包括BVDV在内的5种病原，为口岸检疫探索出一种快速、高通量检测动物疫病的方法。而魏春霞等[35]建立了一种可视化基因芯片检测方法，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点，可在3 h内完成同时对包括BVDV在内的7种牛重要疫病病原的检测，在牛群疫病诊断、净化及流行病学调查等方面具有良好的应用前景。

4 结语

BVDV是影响全球养牛业的主要动物疫病病原之一，在我国感染范围广泛，且具有遗传多样性。准确鉴别检测BVDV，以了解该病在我国的流行现状及主要流行毒株，同时筛查并清除PI牛，为我国BVD的防控及净化提供理论依据及技术支持。目前，诊断BVD的方法很多，每种方法都有适用性，也有局限性，应根据检测目的的差异，选择不同的方法，如牛场临床样本的初筛可选择琼脂扩散试验、ELISA试验及RT-PCR；出入境口岸可选择基因芯片技术、多重荧光定量RT-PCR等高通量检测方法，可快速检测多种病原；对于可疑样本可选择病毒分离培养、免疫荧光及电镜检查等方法进行最终确定，并利用RT-PCR进行遗传进化分析。实际工作中，往往选择几种检测方法对同一样本进行检测，以避免假阳性或非特异性结果的出现。随着分子生物学技术的不断发展，相信会有越来越多更加敏感、特异、快速的检测方法的建立，为BVDV的精准防控奠定基础。