Calreticulin、VRK1、Fbxw7在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及诊断价值研究

张 琳,陈 晨,于艺冰,李一鸣,宋 辉,李峰敏

(秦皇岛市第一医院 血液科,河北 秦皇岛066000)

淋巴造血系统恶性肿瘤是最常见的淋巴瘤，发病率逐年升高，在恶性肿瘤死亡原因中居第10位，其中B细胞型非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)发病占淋巴瘤的90%以上，而NHL中最常见的亚型为弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1-2]。中国的DLBCL发病率占所有B细胞NHL的40%以上，是成人最常见的B细胞NHL。DLBCL分为生发中心B细胞样(germinal center B-cell，GCB)型和非生发中心B细胞样(non-GCB)型[3]。钙网蛋白(Calreticulin)是内质网主要的钙结合蛋白之一，主要分布在细胞质及细胞膜中，参与多个重要的细胞过程，主要包括钙离子平衡调节、基因表达调控、血管生成、细胞黏附、抗原呈递、自身免疫等[4]。牛痘相关激酶1(vaccinia-related kinase1，VRK1)是丝氨酸-苏氨酸激酶VRK家族中的一员，参与细胞分裂、转录激活、DNA修复和组蛋白修饰等[5]。F框/WD40域蛋白7(F-box and WD-40domain protein7,FBXW7)是一种肿瘤抑制因子，控制细胞的增殖、分化、细胞周期进程、凋亡、癌变等多种细胞生物学过程[6]。目前临床中缺乏Calreticulin、VRK1、FBXW7联合检测弥漫大B细胞淋巴瘤的相关研究，本文旨在研究上述因子在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的表达及诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年3月到2021年3月在秦皇岛市第一医院病理科保存的60例DLBCL组织以及癌旁组织；根据发病部位分为颈部淋巴结、腹腔淋巴结、腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、锁骨上淋巴结、纵隔淋巴结。选取同时期在我院病理科保存的正常淋巴组织60例为正常组，两组研究对象基线资料见表1。

纳入标准：(1)符合《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南(2013年版)》[7]诊断标准；(2)本文研究患者及其家属均知情，签署知情同意书，经过我院伦理委员会批准。

排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)精神异常患者；(3)妊娠期、哺乳期患者；(4)进行漫大B细胞淋巴瘤手术前接受放射治疗、化学治疗以及生物学疗法者。

1.2 指标检测

1.2.1采用荧光定量RT-PCR检测Calreticulin、Fbxw7 使用传统的规范Trizol提取方法提取RNA用beckman酶标仪测定Calreticulin、Fbxw7(1)将弥漫大B细胞淋巴瘤组织放入匀浆管中，加入RNA裂解液，用组织匀浆机破碎组织；(2)加入稀释液，混匀，室温放置5-6 min；再加入无水乙醇，混匀，离心10 000 g，半径15 000 r，7 min，弃滤液；(3)反复3次离心、半径、弃滤液，将得到的RNA保存在-80℃；(4)按照Takara反转录试剂盒进行总RNA的反转录；(5)按照Roche LightCycler®480实时定量PCR仪要求；(6)将PCR96孔板4 000 g离心5 min后放入Roche LightCycler®480仪器中，95℃ 5 min为一个循环，95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 10 s为45循环，95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃、40℃ 30 s为一个循环利用公式-△△ct=(实验组目的基因ct值-实验组内参基因ct值)-(对照组目的基因ct值-对照组内参基因ct值)；(7)加入约30 μl DEPC处理的去离子水重新溶解白色沉淀物，即总RNA。

1.2.2采用免疫组织化学法检测组织中VRK1表达 按抗生蛋白链菌素-过氧化物酶(Streptavidin Peroxidase，SP)免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明进行操作。(1)取弥漫大B细胞淋巴瘤组织和瘤旁组织石蜡标本，将石蜡切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇再水合；(2)用配制好的修复液(0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，pH值6.0)PBS冲洗3次,高温高压下进行抗原修复15 min,然后用5%过氧化氯处理，阻断内源性过氧化物酶；(3)滴加稀释好的正常山羊血清封闭抗原。将切片与兔抗人VRK1单抗(稀释比1∶100)在5℃下反应过夜，添加山羊抗兔二抗在37℃下反应30 min，然后用过氧化酶标记的链酶卵白素工作液室温反应30 min，二氨基联苯胺显色液显色，显微镜下控制显色时间，Harris苏木精对比染色，最后进行脱水与封固；(4)在显微镜下观察到在细胞质或细胞核中有棕黄色或棕褐色颗粒即为阳性细胞，高倍镜下观察染色强度并计算阳性细胞，计算阳性细胞比例。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 研究对象基线资料比较

如表1所示，DLBCL组、正常组年龄、性别、BMI、比较无统计差异(P>0.05)，具有可比性。

表1 基线资料比较

2.2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的比较

如表2所示，弥漫大B细胞淋巴瘤组织Calreticulin、VRK1表达高于瘤旁组织、正常组织，Fbxw7表达低于瘤旁组织、正常组织(P<0.05)。瘤旁组织Calreticulin、VRK1表达高于正常组织，Fbxw7表达低于正常组织(P<0.05)。

表2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的比较

2.3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达在弥漫大B细胞淋巴瘤患者病理特征关系

如Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期、分化程度、结外病灶个数、LDH、淋巴转移有关。随临床分期程度加重、分化程度越低、结外病灶个数增加、LDH升高，Calreticulin、VRK1表达不断升高，Fbxw7不断降低(P<0.05)；有淋巴结转移患者Calreticulin、VRK1表达量高于无淋巴结转移者，Fbxw7低于无淋巴结转移者(P<0.05)。

表3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达在弥漫大B细胞淋巴瘤患者病理特征关系

2.4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7对弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断价值

ROC分析Calreticulin、VRK1、Fbxw7单独预测弥漫大B细胞淋巴瘤的曲线下面积(area under the curve，AUC)低于3项联合，具有统计学差异(P<0.05)。3项联合检测灵敏度、准确度高于Calreticulin、VRK1、Fbxw7表达单一检测(P<0.05)，见表4，图1。

表4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7对弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断价值

图1 Calreticulin、VRK1、Fbxw7对弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断价值(ROC曲线)

3 讨论

DLBCL的发生发展与多种遗传信息异常有关，是一个异质性、多步骤的过程，由各种信号通路的异常激活或阻滞引起的异常细胞生长、分化、凋亡均会引发DLBCL[8]。现已明确药物化疗的主要机制是诱导癌细胞凋亡，但最终会引起细胞异常增殖、凋亡受到抑制，进而对化疗产生耐受性[9-10]。

Araki M研究表明[11]，Calreticulin在多种恶性肿瘤中均有表达，如胃腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、肺腺癌、前列腺癌等，在肿瘤中发挥促瘤生长、转移及侵袭等作用,但其在淋巴瘤中尤其是B细胞NHL中表达的临床意义仍不明确。本文研究结果显示Calreticulin在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中高于瘤旁组织和正常组织，其水平的高低与患者的临床分期、分化程度、淋巴转移有关、结外病灶个数、LDH有关，提示Calreticulin可作为弥漫大B细胞淋巴瘤患者的早期诊断辅助标志物。Liu P研究发现[12]Calreticulin在多种恶性肿瘤中的表达增加，且与肿瘤侵袭、淋巴结转移等呈正相关。其原因归结为：Calreticulin是高度保守、普遍存在于哺乳动物细胞内质网腔中的钙结合蛋白，不仅局限在内质网腔，而是涉及参与调节细胞凋亡、应激、钙离子平衡调节等多种生理和病理过程的多功能基因[13-14]。

有研究发现[15-16]VRK1在不同肿瘤中存在差异表达，对肿瘤的发展具有调控作用，如VRK1在胶质瘤、乳腺癌、肝细胞癌、食管鳞状细胞癌、肺癌中发生突变或差异表达，且调控肿瘤的发生。本文研究结果显示VRK1在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中高表达，随临床分期程度加重、分化程度越低、结外病灶个数增加、LDH升高VRK1表达不断升高。Ben等[17]研究发现VRK1在神经胶质瘤组织和细胞系中高表达，VRK1的表达与神经胶质瘤的病理分级呈正相关。与本文研究结果保持一致。

FBXW7基因是人类重要的抑癌基因，它与肿瘤的发生、发展有着密切的联系，FBXW7的缺失与肿瘤化疗过程中的抵抗也有一定关系[18]。有研究证明[19]FBXW7的肿瘤抑制功能可以由多个监管机构、突变、剪接以及上游的细胞信号通路所调控，主要是通过对下游底物的影响导致肿瘤的发生，故恢复其肿瘤抑制功能也是设计治疗癌症患者的新思路。本研究经ROC分析显示FBXW7对弥漫大B细胞淋巴瘤诊断价值的AUC达0.711，灵敏度和特异度分别为0.596%、0.825%，提示FBXW7可作为弥漫大B细胞淋巴瘤患者的早期诊断辅助标志物。有研究发现[20]FBXW7在肿瘤中抑制蛋白，在多种恶性肿瘤中低表达，包括急性T淋巴细胞白血病、胃结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胆管上皮癌、胰腺癌、食管鳞状细胞癌等，这与本文研究结果一致。

综上所述，Calreticulin、VRK1、FBXW7在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中表达异常，其表达水平的高低与临床分期、分化程度、淋巴转移有关、结外病灶个数、LDH升高有关，三者联合对弥漫大B细胞淋巴瘤患者的诊断价值显著。

作者简介：张琳(1986-)，女，主治医师，研究生学历，主要从事血液科常见病的临床和科研工作。