DKK3及CDKN2A基因甲基化在急性髓系白血病患者中的分析*

刘明君，贾国荣 ， 冯 于， 刘学文

(1.内蒙古科技大学包头医学院研究生学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院血液科；3.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院血液科)

急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)是目前临床上最常见的血液系统恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年递增态势，但该疾病发生机制至今尚未完全阐明[1]。在血液系统恶性肿瘤中，DNA甲基化普遍存在，甲基化后的DNA能够阻止转录因子与之结合，导致基因低表达或不表达，是恶性肿瘤性疾病早期发生发展的重要变化之一。因此一些特定的基因甲基化可作为AML患者预后评价及疾病监测的标志物[2]。Wnt信号转导通路(wingless pathway)是重要的细胞信号分子，是一条参与调节细胞的生长、迁移、分化及凋亡的信号通路，是肿瘤发生过程中的关键信号通路之一，Wnt信号转导通路的异常活化与肿瘤的形成密切相关[3-4]。DKK3基因为Wnt信号传导通路的拮抗剂，可抑制Wnt信号途径的活化，具有调控细胞增殖和凋亡的功能，与多种肿瘤的发病机制、病情及预后有密切联系[5]。细胞周期性激酶抑制因子A，CDKN2A基因是位于9p21.3染色体区域，是多种恶性肿瘤中杂合性缺失的位点，是一种十分重要且常见的肿瘤抑癌基因[7]。国内外研究证实DKK3及CDKN2A基因甲基化广泛存在于肿瘤性疾病中，故本研究旨在探索DKK3及CDKN2A基因甲基化在急性髓系白血病患者中潜在的临床临床价值，为AML患者的微小残留检测提供理论依据。

1 对象与方法

1.1对象 研究对象选取2017年1月-2020年9月就诊于内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院血液科急性髓系白血病患者，其中初发患者50例，完全缓解6个月患者31例，复发患者16例。营养不良性贫血患者12例。

1.2标本收集 入组标准： 性别、年龄不限，AML患者诊断标准采用成人急性髓系白血病中国诊疗指南(2017版)，AML组经骨髓细胞学及免疫组化确诊为急性髓系白血病(初发患者未经过任何化疗性药物治疗)；完全缓解患者标准采用张之南血液系统疾病诊疗标准(第三版)，复发患者采用复发难治成人急性髓系白血病中国诊疗指南(2017版)[6]。对照组经血常规、铁代谢、骨髓涂片、骨髓铁染色确诊为缺铁性贫血(通过影像学及消化内镜除外其他系统恶性肿瘤性疾病)；在征得患者知情同意后，在行常规骨髓检查时，抽取患者新鲜骨髓液2 mL置于含有EDTA-K2抗凝剂的采血管中，同时为防止DNA迅速降解，骨髓液立即放置于超低温冰箱中留存使用。

1.3主要实验试剂及仪器 DNA引物及探针:上海生物工程有限公司设计合成；DNA提取试剂盒：北京天根生化公司 TIANamp Blood DNA Kit；亚硫酸盐修饰试剂盒：德国Qiagen公司 EpiTect Bisulffite Kit(48)；实时定量PCR试剂：德国Qiagen公司 EpiTect MethyLight PCR Kit(200)；实时定量PCR仪：百源ASA-9600；Ⅱ-2型生物安全柜：购自珠海再鑫仪器有限公司；XiangYiH-1850R高速低温离心机:长沙湘仪仪器有限公司。

1.4实验方法

1.4.1DNA提取 提取患者200 μL骨髓液，依据TIANamp Blood DNA Kit说明书提供方法逐步添加试剂，最后以50 μL洗脱液洗脱DNA,并以微量紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度并记录(放入-80℃冰箱冻存，以备亚硫酸盐修饰使用)。

1.4.2亚硫酸盐修饰 依据EpiTect MethyLight PCR Kit说明书提供方法添加试剂,每次投入约500 ng DNA(约5 μL)进行亚硫酸盐转化，最后用20 μL洗脱液洗脱DNA,洗脱后的DNA以微量紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度并置于-80 ℃冰箱冻存。

1.4.3甲基化MSP检测 根据说明书方式调配PCR反应体系，PCR反应条件为：首先95 ℃预变性 5 min，然后94 ℃变性20 sec，60 ℃退火 30 sec，72 ℃延伸20 sec，共35个循环，最后72 ℃延长5 min。

琼脂糖凝胶电泳：配制琼脂糖凝胶，将制成的凝胶电泳板放入电泳槽中，依次加入5 μL DNA Marker、5 μL PCR产物，在电压为110 V的条件下电泳35 min；取出电泳后的凝胶,由上海嘉鹏凝胶成像系统中Bio Sens Gel Imaging System 软件照相处理，并保存图片。

1.4.4甲基化QMSP检测 按比例配置PCR反应液体系；定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR)采用QMSP方法检测DKK3及CDKN2A基因启动子区甲基化，针对亚硫酸盐转换后的目的DNA序列设计引物及探针。引物及探针序列：DKK3基因Forward：5’-TGTTTTTTGTGTGTATATTTTTGTT-3’Reserve： 5’-TCCAAAACTCCATCAAACTCTAAC-3’Probe：5’-AGGGCGAGTTTTGTTATGATTTCGTTAG-3’：CDKN2A基因Forward：5’-GATTTAGGTTATGATGATGGGTAGC-3’ Reserve：5’-GTACACGAATCGAATAAAAATAACG-3’ Probe：5’-CGAGTGGCGGAGTTGTTGTTG-3’ ；内参基因Forward：5’--GTGGACATCCGCAAAGAC-3’ Reserve：5’-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3’ 。QMSP反应体系：总体积50 μL，2×EpiTect MethyLight 25 μL,亚硫酸盐转换后DNA 5 μL；RNase-free water 15 μL，正、反向引物各2 μL，Probe1 μL(共计5 μL)。PCR反应体系扩增循环参数：45个循环，PCR酶激活 95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s；延长 60 ℃ 60 s；数据收集分析。

MSP应用 M-primer出现扩增产物者为完全性基因甲基化,表明存在基因甲基化，应用 U-primer出现扩增产物者为完全性基因非甲基化,为不存在基因甲基化，若应用甲基化引物和非甲基化引物同时出现扩增产物则为部分甲基化，也定义为存在基因甲基化。

QMSP实验结果以GAPDH作为内参基因，计算公式2(CTGAPDH-CT目的基因)法计算DKK3及CDKN2A基因 DNA 甲基化的相对表达水平。每个样品孔需重复检测最少3次，取检测结果平均值[8]。

1.5统计学分析 所有实验数据使用SPSS 25.0及Graphpad 8.0软件进行统计学分析，不同组别之间对照选取卡方检验，DKK3及CDKN2A基因 DNA甲基化各时期的甲基化水平的相关性分析采用Mann-Whitney U 秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义[9]。

2 结果

2.1对不同病程AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化阳性率 对照组中DKK3及CDKN2A基因甲基化检出率分别为8.3 %(1/12)，0 %(0/12)；在初发组50例AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化阳性率分别为88.0 %(44/50),58.0 %(29/50)，与对照组比较具有统计学差异(P<0.001)。缓解组31例AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化阳性率分别为25.8 %(8/31),9.7 %(3/31)，与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。复发组16例AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化阳性率分别为75.0 %(12/16),56.3 %(9/16)，与对照组比较具有统计学差异(P<0.001)。见表1-2。

表1 DKK3基因甲基化状态统计分析[n，(%)]

表2 CDKN2A基因甲基化状态统计分析表[n，(%)]

2.2AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化与病理分型的相关性 AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化检出率与临床病理分型均无关(P>0.05),见表3-4。

表3 DKK3基因甲基化与FAB分型分析(n， %)

表4 CDKN2A基因甲基化与FAB分型分析

2.3对16例AML患者中DKK3及CDKN2A基因甲基化不同时期的相对表达分析 在对16例DKK3及CDKN2A基因甲基化阳性患者进行监测，其中治疗6个月后完全缓解患者12例，其中5例复发，DKK3基因相对表达量，初发组与缓解组存在统计学差异(P<0.0001)，缓解组与复发组存在统计学差异(P<0.05)，初发组与复发组无统计学差异(P>0.05)，CDKN2A基因相对表达量，初发组与缓解组存在统计学差异(P<0.0001)，缓解组与复发组存在统计学差异(P<0.05)，初发组与复发组存在统计学差异(P<0.05)。见图1-2。

图1 CDKN2A基因DNA相对表达量分析

图2 DKK3基因DNA相对表达量分析

3 讨论

随着对急性白血病的不断研究深入，发现表观遗传学在AML的发病过程中存在重要的临床意义，也成为了对AML监测研究的主要方向[10]。目前对表观遗传学的监测多以DNA甲基化及mRNA检测为主[11-12]。抑癌基因甲基化是恶性肿瘤性疾病发生的重要环节之一，在对恶性肿瘤性疾病的发生发展的调控中起着十分重要的作用。通过对特定基因甲基化水平的检测，是临床监测恶性肿瘤性疾病演变及转归的重要途径之一[13]。DKK3基因是抑癌基因，其蛋白质有抑制细胞增殖的能力，DKK3启动子区富含CPG岛，启动子区域的异常甲基化状态导致DKK3基因的表达下调、沉默[14]。DKK3基因的表达沉默导致其失去对通路的抑制作用，导致细胞无限增殖,肿瘤形成[15-16]。CDNK2A基因作为最重要的抑癌基因之一，主要编码p16周期抑制性蛋白，其主要功能为抑制细胞的周期，使细胞无法由G1期进入到S期，进而造成细胞周期的停滞，进而达到抑制肿瘤细胞增值，是继P53基因后第二常见的抑癌基因,CDKN2A基因的缺失、突变和甲基化可引起细胞周期活化，有助于肿瘤的发生[17-18]。

目前对AML的诊断标准及危险分层在临床诊疗过程中已得到基本认同，但对于多数患者仍将面临复发，尤其是在非APL患者中，目前临床上没有高度敏感和特异性的监测指标[19]。通过本次实验研究发现，在入组的94名急性髓系白血病中，DKK3及CDKN2A基因甲基化率明显高于对照组，且与年龄无明显相关性。研究表明DKK3及CDKN2A基因甲基化在急性髓系白血病患者中有着十分重要的临床意义，通过对DKK3及CDKN2A基因甲基化的联合检测，可以评价患者的预后[20]。本研究在通过对16例初发时DKK3及CDKN2A基因甲基化均为阳性的患者进行监测，在进行去甲基化治疗6个月后再次检测甲基化水平，发现经治疗后甲基化水平较初发时明显减低，且在复发时基因甲基化水平再次升高。实验结果说明，DKK3及CDKN2A基因对于部分急性髓系白血病患者，在经去甲基化治疗后判断达到完全缓解时存在一定的检测价值，且在预测完全缓解后复发的趋势也存在监测的临床价值，对于FAB分型患者缺乏临床特异性。初发时甲基化水平高低与病情轻重无明显关联，且与复发也无明显相关性。因此通过联合检测DKK3及CDKN2A基因甲基化水平对急性髓系白血病患者的评估预测有着十分重要的临床价值。但目前随访患者病例数较少，部分临床数据丢失，本研究可再次通过增加临床病例进行检测，进而评估基因甲基化水平对急性髓系白血病患者的监测意义。