乳腺癌LAT1表达及micro-PET示踪检测

孙新六

泰安市中心医院中心实验室，山东 泰安 271000

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，许多细胞分子与乳腺癌的发生和进展相关［1］，但用于诊断和治疗乳腺癌效果不佳，需要寻求新的生物标志物。L-型氨基酸转运蛋白1（LAT1）是一种中性氨基酸转运蛋白，是运输中性氨基酸进入细胞的重要载体［2］，LAT1在某些恶性肿瘤细胞中高表达［3］。氨基酸是合成蛋白质所必需，积极增殖的癌细胞比静态细胞需要更多的 氨 基 酸［4］。18F-氟 环 丁 烷 羧 酸（18Ffluorocyclobutane carboxylic acid，18F-FACBC）是一种合成的L-亮氨酸模拟分子，能通过LAT1被癌细胞吸收［5］。本研究旨在探讨LAT1在乳腺癌中的表达及18F-FACBC与LAT1用于小动物正电子断层扫描仪（micro-PET）示踪检测乳腺癌的价值。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

总RNA提取Trizol试剂购于ThermoFisher公司；荧光PCR试剂盒购于TaKaRa公司；免疫组化试剂购于博士德生物公司。micro-PET购于美国Sofie Biosciences公司，18F-FACBC购于美国PerkinElmer公司。

1.2 细胞系与细胞培养

选择恶性MCF-7和非致瘤性MCF-10A细胞株，用添加10%的胎牛血清的RPMI1640液在5%CO2、37℃培养箱中培养，培养液中加入终浓度为50 U/mL青霉素和50µg/mL链霉素。

1.3 细胞总RNA提取与定量分析

采用Trizol试剂从培养的细胞株提取总RNA。离心收集约5.0×106个培养的乳腺癌细胞，按照Trizol试剂盒说明书操作提取RNA。测定总RNA纯度并调节其浓度用于荧光定量PCR。引物序列：LAT1上游5'-AGGAGCCTTCCTTTCTCCTG-3'和下游5'-CTGCAAACCCTAAGGCAGAG-3'。内参基因β-actin上游5'-AGCGGGAAATCG TGCGTG-3'和下游5'-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3'。取500 ng总RNA进行逆转录，20µL反应体系，42℃，45 min生成cDNA。取1µl cDNA液进行荧光定量PCR（20µL反应体系）：95℃，10 min；35次循环：95℃，30 s；54℃，20 s；72℃，30 s。按2-△△Cq法计算MCF-7和MCF-10A细胞株中LAT1 mRNA表达水平的差异倍数。每个标本重复三管检测3次。

1.4 Western blotting检测

收集培养的两组乳腺癌细胞，经细胞裂解液处理，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取2 mg蛋白质进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析。使用针对LAT1单克隆抗体（1∶1 000）和针对β肌动蛋白单克隆抗体（1∶1 000），采用酶化学发光检测蛋白相对表达量，蛋白条带使用Image J软件分析。

1.5 细胞摄取实验

检测MCF-7和MCF-10A细胞株的氨基酸吸收能力。约2×106个细胞暴露于5µCi18FFACBC，37℃孵育60 min。收集培养的细胞，离心，用冰冷的无血清HBSS培养液漂洗除去上清液中残留的放射素。用γ放射素自动计数器测量，计算每2×106个细胞摄取的放射素量。

1.6 LAT1抑制剂抑制细胞增殖

MCF-7细胞接种于96孔培养板，加入终浓度10 mM的LAT1抑制剂BCH后，作用24 h，以MTT法测定细胞增殖性。

1.7 不同分期乳腺癌LAT1表达

选取泰安市中心医院手术摘取的乳腺癌标本共40例（T1~T4期每期各10例），年龄34~52岁，平均（42.6±7.2）岁。患者同意参与本研究且签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会批准。标本制成石蜡组织切片并免疫组化染色，一抗LAT1单克隆抗体（1∶500稀释）作用1 h，漂洗后加入HRP标记的二抗，最后加入DAB显色。染色强度规定为：++++，非常强；+++，强；++，中等；+，弱。计算阳性肿瘤细胞的百分比（0~100%），两者之积作为染色强度计分，总的计分范围为0~400，染色强度≥100被认为是阳性。

1.8 micro-PET示踪检测

建立18F-FACBC-PET检测乳腺癌动物模型。MCF-7乳腺癌细胞注射到裸鼠乳腺脂肪组织，当肿瘤平均体积达到500 mm3时，裸鼠经尾静脉注射100µL含100µCi18F-FACBC液体，作用1 h后，将小鼠麻醉，固定在micro-PET仪器上。获得基于CT的衰减扫描数据，总共获取30 min的影像，将得到的图像重建、显示和分析。荷瘤裸鼠拍摄micro-CT作为对照。

1.9 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 LAT1在乳腺癌细胞系中的表达

实时荧光定量PCR分析（图1）显示，MCF-7细胞株LAT1 mRNA高水平表达，MCF-10A细胞株LAT1 mRNA低水平表达，MCF-7细胞株LAT1 mRNA表达水平为非致瘤性MCF-10A细胞株的4.21倍，两组比较差异有统计学意义（t=35.570，P<0.001），见表1。

表1 LAT-1基因相对表达（倍数）

图1 LAT-1基因表达

2.2 Western blotting分析

蛋白质电泳转膜后免疫印迹（图2）显示，恶性肿瘤细胞MCF-7细胞株表达高水平的LAT1蛋白，而非致瘤MCF-10A细胞株表达水平明显降低。MCF-7细胞株中LAT1蛋白表达水平是MCF-10A细胞株的（2.62±0.61）倍，两组比较差异有统计学意义（t=12.450，P<0.001），见表2。

图2 LAT-1蛋白表达

表2 LAT-1蛋白相对表达（倍数）

2.3 18F-FACBC细胞摄取实验

恶性乳腺癌细胞株MCF-718F-FACBC细胞摄取率为（36.2±6.4）%，非致瘤MCF-10A细胞株摄取率为（16.4±4.6）%，两组比较差异有统计学意义（t=11.410，P<0.001），见表3。表明乳腺癌细胞通过LAT1对18F-FACBC的摄取率更高。

表3 18F-FACBC细胞摄取率

2.4 LAT1抑制剂作用

采用BCH选择性抑制LAT1，MCF-7细胞培养于含10 mM BCH培养基中培养24 h，MCF-7细胞存活率（62.4±10.6）%，与未加BCH对照组比较明显减少，差异有统计学意义（t=14.250，P<0.001），见表4。显示LAT1参与了乳腺癌细胞的增殖。

表4 BCH抑制作用

2.5 LAT1表达与乳腺癌进展的相关性

乳腺肿瘤标本经石蜡组织切片免疫组化染色（图3）后计分，T3+T4期乳腺肿瘤表达高水平LAT1（计分：256±36），而T1+T2期的乳腺肿瘤表达较低水平LAT1（计分：161±23），差异有统计学意义（t=9.945，P<0.001），见表5。结果表明LAT1表达水平与乳腺癌的进展相关。

表5 乳腺癌临床分型与LAT-1表达

图3 乳腺癌组织LAT-1免疫组化染色（×200）

2.6 micro-PET示踪检测

建立乳腺癌裸鼠模型，输入18F-FACBC液，分别做micro-CT和micro-PET。18F-FACBC micro-PET能精确显示乳腺肿瘤位置（图4）。

图4 荷瘤裸鼠micro-PET示踪检测

3 讨 论

乳腺癌是女性常见肿瘤，传统的乳腺癌手术治疗效果欠佳，早期发现并进行针对性的靶向治疗对患者至关重要。LAT1在骨肉瘤、肾癌等多种肿瘤中高表达［6］，能促进肿瘤细胞摄取氨基酸［7］。LAT1已被证明在某些肿瘤组织中过表达及参与血管平滑肌细胞增殖［8］。本研究显示，LAT1在乳腺癌细胞系MCF-7中高度表达。乳腺癌细胞LAT1活性增强，更易摄取氨基酸。T3和T4期恶性乳腺肿瘤组织LAT1免疫染色评分较高，T1和T2期肿瘤组织评分较低，表明LAT1表达水平与乳腺癌的进展相关。此外，为了探讨LAT1是否参与乳腺癌细胞的增殖，本研究采用选择性LAT1抑制剂BCH，抑制恶性肿瘤细胞LAT1活性。结果显示LAT1抑制剂能抑制乳腺癌细胞的增殖，表明LAT1表达能促进乳腺癌细胞的生长和进展。

18F-FDG-PET被认为是诊断肿瘤有效的临床影像工具［9］，然而很多炎性疾病和某些良性肿瘤也呈现较高的18F-FDG摄取［10］，因而限制了18F-FDG-PET的临床应用，所以需寻找新的替代示踪剂。本研究显示培养的乳腺肿瘤细胞对18F-FACBC具有高摄取性，乳腺癌裸鼠模型显示乳腺肿瘤对18F-FACBC具有优良的吸收率，因此，18F-FACBC-PET可能是一个潜在的非侵入性诊断乳腺癌的方法。18F-FACBC示踪剂具有对癌细胞特异性强、半衰期长、制备简单等优点［11］，是有潜力的新型PET显像剂。micro-PET为“活体生化显像”技术，可以实现对小动物的活体扫描和定量分析［12］，它具有空间分辨率高、体积小、造价低等优点［13］，在疾病诊断、药物研究等领域有着广泛的应用前景［14］。

综上所述，本研究显示LAT1能促进乳腺癌进展，可能是对乳腺癌诊断和治疗的一种潜在生物标志物，18F-FACBC是micro-PET诊断乳腺癌的有效示踪剂，18F-FACBC-PET可用于精确诊断乳腺癌。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突