miR-17-92基因簇在子宫内膜病变组织中的表达及临床意义

接智慧 周 岩 杨海燕 杨洪川 程俊兰 许 文

山东第一医科大学第二附属医院1.妇产科；2.病理科，山东 泰安 271000

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率居第二位，发病率逐年上升，且呈现年轻化趋势，严重威胁女性健康［1］。目前，早期EC患者5年总存活率达96%［2］；对于晚期EC，即使采用手术、放化疗及内分泌治疗等联合的综合治疗方式，预后也并不理想，患者的生存率较低［3］。因此，临床上迫切需要寻找与EC形成相关，并且有助于EC早期诊断、预后预测的分子靶标。近年来研究认为，miR-17-92基因簇是一个与肿瘤形成有关的基因，在一系列人类肿瘤如淋巴瘤、白血病、宫颈癌和卵巢癌中均存在miR-17-92的异常表达［4］。目前，关于miR-17-92基因簇与EC关系的研究较少。在前期研究中，本团队发现miR-17-92基因簇在EC Ishikawa、HEC-1A细胞系中存在异常表达［5］，因此本研究拟在前期研究的基础上，分析子宫内膜病变组织中miR-17-92基因簇的表达，探讨其异常表达情况与EC临床病理特征和预后的关系。

1 资料和方法

1.1 资料与试剂

1.1.1 研究标本 选取2009年1月至2015年5月于山东第一医科大学第二附属医院妇科就诊并经病理诊断为EC且行手术治疗的患者105例。纳入标准：（1）病理确诊为EC；（2）术前未行放化疗及内分泌治疗；（3）有完整的病历资料。排除标准：（1）有其他肿瘤病史；（2）合并内分泌代谢性疾病或免疫系统疾病；（3）合并全身感染。选取切除的EC组织，作为EC组，患者年龄26~70岁，中位年龄53.5岁，其中Ⅰ型EC 87例，Ⅱ型EC 18例，根据国际妇产科联合会（international federation of gynecology and obstetrics，FIGO）2009标准，其中Ⅰ、Ⅱ期患者72例，Ⅲ、Ⅳ期患者33例，FIGO I级29例，FIGO II级48例，FIGOⅢ级28例。另收集同期非典型增生子宫内膜患者36例，作为非典型增生组，患者年龄32~66岁，中位年龄50.85岁；因宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIA）Ⅲ行全子宫切除术的患者22例，作为正常子宫内膜组，其中增生期内膜组织13例，分泌期内膜组织9例，患者年龄38~62岁，中位年龄48.4岁。所有患者术前均未进行内分泌治疗或放化疗。标本收集后均立即进行液氮速冻处理并存于-80℃冰箱中备用。本研究经山东第一医科大学第二附属医院伦理委员会批准，所有入组患者或家属均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒购自美国Axygen公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，cDNA逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，miRNA逆转录试剂盒购自上海吉玛技术有限公司，qRT-PCR检验试剂盒购自珠海莫纳生物科技公司，miR-17-92基因簇及内参基因U6引物由上海生工生物有限公司合成，Nanodrop分光光度计购自美国Thermo公司，qRT-PCR扩增仪ABI 7500购自美国应用生物系统公司。

1.2 qRT-PCR检测miR-17-92基因簇表达

采取Trizol法提取组织中总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度（要求OD 260/OD 280比值在1.8~2.0），按逆转录试剂盒说明将RNA反转录成cDNA，cDNA产物置于-20℃冷冻保存备用。引物序列：miR-17-92基因簇上游引物：5'-AAGGGCCGCAGCTTACACAT-3'，下 游 引 物：5'-TCCCTCACTTTGCTTCTCTTTTGAC-3'；U6上 游引物：5'-AAGGCAGCACACTCGCTTC-3'，下游引物：5'-TGGTCCGAGTGTGGTTCTGT-3'。qRT-PCR扩增仪检测miR-17-92基因簇相对表达水平，qRT-PCR扩增体系为20µL，反应条件：预95℃变性5 min，95℃10 s；63℃20 s；72℃20 s；76℃20 s，共40个循环。每一样本重复3次。采用2-∆∆Ct法表示miR-17-92基因簇的相对表达量。

1.3 随访

随访采用电话或者门诊随访。随访时间为患者术后5～79个月，中位随访时间37个月，随访终点事件为患者死亡或者到达随访截止时间（2020年5月）。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，两组比较采用成组t检验。计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，Kaplan-Meier法分析EC患者术后生存情况，组间比较采用Log-rank检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 不同组织中miR-17-92基因簇表达情况

miR-17-92在EC组织中的相对表达量为1.489±0.038，非典型增生组织中的相对表达量为1.046±0.029，正常内膜组织中相对表达量为0.621±0.032，miR-17-92在EC组织表达显著高于非典型增生组织和正常内膜组织，差异均有统计学意义（t=2.6827，P=0.016；t=5.0166，P=0.001），结果详见图1。

图1 miR-17-92基因簇在子宫内膜组织中的表达情况

2.2 miR-17-92的表达与EC临床病理特征的关系

分析显示在未绝经患者EC组织中miR-17-92的表达（1.501±0.038）高于已绝经患者EC组织（1.486±0.029），差异有统计学意义（t=2.257，P=0.026）；miR-17-92基因簇的表达与EC的病理类型相关，分析显示在Ⅰ型EC组织中的表达（1.505±0.017）高于Ⅱ型EC组织（1.476±0.023），差异有统计学意义（t=6.178，P<0.001）；miR-17-92基因簇的表达与EC肌层浸润深度明显相关，分析显示在>1/2肌层浸润组织中的表达（1.523±0.040）高于≤1/2肌层浸润组织（1.469±0.037），差异有统计学意义（t=-7.091，P<0.001）；而miR-17-92基因簇的表达与患者年龄、FIGO分级、有无淋巴结转移及肿瘤分期无关，结果见表1。

表1 miR-17-92基因簇表达与EC临床病理特征的关系

2.3 miR-17-92的表达对EC预后的影响

以中位值为界限，将EC患者分为miR-17-92低表达组53例，中位生存时间为60个月，miR-17-92高表达组52例，中位生存时间为37个月，采用Kaplan-Meier法分析miR-17-92的表达与EC患者预后的关系，结果显示，miR-17-92高表达组和低表达组的患者5年生存率分别为33.9%和49.5%，Logrank检验结果显示，miR-17-92高表达组患者的生存时间低于低表达组，差异有统计学意义（χ2=4.074，P=0.043），见图3。

图3 miR-17-92的表达与EC患者预后的关系

3 讨 论

大量研究已经证实，多种miRNA在EC中的异常表达可以影响肿瘤进展，如miR-944在EC中表达上调，促进肿瘤的侵袭［6］；miR-125a-5p在EC RL95-2细胞中高表达后，能够改变PI3K/AKT/mTOR通路活性及调节凋亡相关基因的转录，进而抑制EC RL95-2细胞增殖［7］。由于一个miRNA可以靶向调控多个靶基因，一个靶基因也可以同时受到多个miRNA的调控，不同miRNA通过调控多个基因形成的信号网络在肿瘤的生物学行为调控中起更加重要的作用［8-10］，miRNA基因簇具有一个启动子区，可转录形成多个成熟miRNA的基因簇，同一个miRNA基因簇转录形成的miRNA在生物学调控中发挥协调作用［11］，因此目前关于miRNA的基因簇在肿瘤发生、发展中的作用已成为转录后调控机制研究的新热点。miR-17-92是第一个被发现的miRNA癌基因簇［12］，其在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌等细胞中高表达，并且参与多种类型的肿瘤细胞增殖过程［4］。在前期研究中，本团队发现miR-17-92在EC Ishikawa、HEC-1A细胞系中均表达上调［5］。本研究检测了miR-17-92在子宫内膜病变组织中的表达情况，显示其在EC癌组织中的表达显著高于非典型增生和正常内膜组织，经过分析癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库，EC组织中miR-17的表达也显著高于正常内膜组织，这与本团队前期研究结果一致。分析EC组织中miR-17-92表达与患者临床病理特征之间的关系，显示miR-17-92基因簇在深肌层浸润EC患者中表达高于浅肌层浸润者，提示其可能促进了EC对周围组织浸润和转移。Chen等［13］发现miR-92a通过靶向磷酸酶与张力蛋白同源物蛋白（PTEN）促进结肠癌SW480细胞的侵袭及转移。Su等［14］在宫颈癌中也发现miR-17-92基因簇的相同作用。在前期研究中，本团队通过生物信息学软件预测Mfn2是miR-17-92的靶基因之一，研究发现Mfn2与肿瘤的侵袭、转移密切相关［15］，因此本研究推测miR-17-92可能通过靶向Mfn2调控EC细胞的侵袭和转移，在后续研究中本团队将对miR-17-92基因簇促进EC肿瘤细胞转移的具体机制进行探究。

本研究还发现miR-17-92基因簇在Ⅰ型EC组织中表达显著高于Ⅱ型EC组织，前者为雌激素依赖EC，本团队前期研究通过生物信息学方法富集了miR-17-92基因簇参与的信号通路和分子调控网络，结果显示miR-17-92基因簇通过调控靶蛋白参与EC信号通路和Wnt信号通路［5］，Wang等［16］研究认为在月经周期、内膜增生及内膜癌变过程中，Wnt信号通路具有维持雌激素诱导细胞增殖和孕激素诱导细胞分化之间平衡的作用，这提示miR-17-92可能通过与女性雌激素的相互作用，调控Wnt信号通路在内的多条信号通路，导致EC的发生，这为EC的激素治疗提供了一个新的可能靶点。

此外，本研究对miR-17-92基因簇表达与EC患者预后关系进行了分析，结果显示miR-17-92基因簇高表达的EC患者，术后5年总生存率和平均生存时间均低于miR-17-92低表达患者，提示miR-17-92基因簇高表达是EC患者预后差的危险因素。通过对TCGA数据库中的大量随访信息进行分析，发现miR-17-92基因簇成员之一的miR-17的表达水平与EC患者的生存时间也呈现负相关，这与本研究的预后分析结果一致。以上结果提示miR-17-92基因簇具有作为EC患者不良预后预测的生物靶标的潜能。

综上所述，miR-17-92基因簇在EC组织中异常高表达，并与EC临床病理因素和预后相关，可能参与了EC的发生及发展过程，有望成为EC诊断和治疗的分子靶点。因此，深入研究miR-17-92基因簇在EC发生、发展中的详细机制有重要的理论和实际意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突