甲状腺素在骨髓间充质干细胞成软骨诱导过程中的作用

刘瑾春，李宁，郑秀花，张瑞霞，杨晓红

（1.河南护理职业学院 临床医学系诊断教研室，河南 安阳 455000；2.河南省中医药研究院附属医院康复医学科，河南 郑州 450003）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是软骨组织工程中重要的种子细胞之一［1］。通过微粒体培养体系，目前在体外应用微粒体培养体系和含有转化生长-β 的无血清培养液作为软骨诱导液，已经能成功诱导BMSCs向软骨分化［2］。但由于现行诱导方法仍不够成熟，以BMSCs 为种子细胞的组织工程化软骨组织构建距临床应用尚有很大差距［3］。所以寻找一种高效、经济的诱导方法，是实现以BMSCs 为种子细胞的软骨组织工程走向临床应用的关键。

甲状腺激素是生长板中骨骼成熟的有效调节因子。生长板细胞对甲状腺激素（T3）非常敏感［4］，在临床上，甲状腺毒症和甲状腺功能减退症，分别代表甲状腺激素的病理性增多和减少，对幼儿的生长发育具有重要的影响。在基础研究中发现，甲状腺素低下的小鼠会出现骨骺板内软骨细胞增殖层和肥大层细胞减少，导致骺板厚度的降低［5］，而生理浓度的甲状腺素能够刺激胚胎软骨组织的生长和体外成熟［6］。因此笔者通过本研究探讨关于甲状腺激素在体外BMSCs 成软骨诱导方面的作用和对软骨细胞肥大的影响。

1 材料和方法

1.1 猪BMSCs 的分离、培养和扩增

健康小型猪（日龄10～15 d）用常规方法抽骨髓5 mL，加入DMEM 培养液30 mL，混匀，1 500 rpm 离心10 min，弃上清，反复洗涤2 次。离心后加入10 mL 10%胎牛血清低糖DMEM 培养液，混匀；取少量细胞悬液，用4%乙酸1∶1 破坏红细胞，常规计数；以DMEM 培养液稀释至4×106个有核细胞/mL，于100 mm 培养皿内按6×105个有核细胞/cm2的细胞密度接种。置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养，培养至4～5 d 换液，此后每2～3 d 换液1 次，常规传代培养。弃培养液，PBS 洗涤1 次，加入2.0 mL 细胞消化液，常规在镜下观察，见大部分细胞离壁后，吸除消化液，中止消化，收集细胞至离心管，1 500 rpm 离心5 min，弃上清液，洗涤，离心。重复洗涤1 次，弃上清液，加入DMEM 培养液混匀，台盼蓝染色，计数，以1.5×104/cm2的密度接种，置于37℃、5%CO2、100% 饱和湿度的条件下培养，每2～3 d 换液1 次，达到融合状态可继续传代培养，收集第3 代（P3）细胞，离心形成Pellets。

1.2 Pellet 培养及分组设计

P3 BMSCs 按上述方法获得。将1 mL 小份细胞悬液（密度为5×105cells/mL）置于15 mL 聚丙烯管中，并以600×g 离心5 min 以形成Pellets 颗粒，然后将这些Pellets 颗粒分为两组，在表1 所列的培养基中培养。

表1 软骨诱导培养液成分与分组设计

1.3 MTT 生长曲线测定

MTT 曲线测定时，平面培养的骨髓间充质细胞被分为2 组，按照上述分组的培养基培养。MTT 的测定方法：第3 代骨髓间充质细胞（P3）接种于96 孔板（美国Corning 公司）内，每孔内细胞数为2 000。在1 至7 天的同一个时间点，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，pH7.4，PBS 液溶解），培养4 h 弃去培养液，每孔加1 mL DMSO，在摇床上裂解10 min，于490 nm 波长处测定裂解液的光吸收值。以DMSO 溶液为空白对照。所有样本读取6 个平行样本进行统计。

1.4 组织学检测

取材，4%多聚甲醛中固定，时间为24 h，脱水，石蜡包埋，切片（5 μm），然后进行HE 染色和甲苯胺蓝染色。

1.5 总RNA 的提取

取材剪碎，加入1 mL TRIzol 试剂，室温静置（5 min），加入4℃氯仿400 μL，剧烈振荡，时间为10 s，室温静置（15 min）；4℃，12 000 rpm 离心15 min，取上清0.5 mL，加500 μL 冷异丙醇混匀，静置（10 min），4℃，12 000 rpm 离心10 min；弃上清，加1 mL 75%乙醇［稀释0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）］，振荡；离心，4℃，7 500 rpm 离心10 min；弃上清；50 μL 0.01%DEPC 水溶解，混匀，测光密度（OD）值，调整RNA 浓度至1 μg/μL，瞬时离心，-80℃保存。

1.6 定量逆转录聚合酶链反应

定量PCR 分析采用生物Rad-CFX96TM-PCR机进行PCR 循环。表2 列出了猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Col-Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Col-Ⅹ）、性别决定基因9（SOX9）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Runt 相关转录因子2（RUNX2）和基质金属蛋白酶13（MMP13）的引物序列。反应曲线：94℃下预变性2 min；PCR 扩增40 个循环，94℃下15 s，60℃下30 s，随后进行一系列循环，然后进行熔体曲线分析，以确保反应特异性。将各基因的表达水平用GAPDH 标准化。将对照组靶基因表达量设为1，用2（-△△CT）法显示实验组与对照组的基因表达。

表2 定量RT-PCR 引物序列

1.7 统计学方法

所有测量数据用SPSS 11.0 软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺素促进了BMSCs 增殖

在两种条件培养基中培养的BMSCs（P3）表现出不同的生长速率（图1）。前4 d 两组细胞生长速度差异无统计学意义（第1 天：t=0.000，P=1.000；第2 天：t=1.113，P=0.292；第3 天：t=0.924，P=0.377；第4 天：t=1.951，P=0.080）。从第5 天到第8 天，T3 组的生长速度明显高于对照组，差异有统计学意义（第5 天：t=4.652，P=0.001；第6 天：t=4.277，P=0.002；第7 天：t=4.814，P=0.001；第8 天：t=5.636，P＜0.001）。

2.2 组织化学检查

对照组软骨细胞培养液诱导的BMSCs 颗粒形成了具有腔隙样结构的软骨样组织，周围区域甲苯胺蓝染色阳性（图2A、图2C），表明各组细胞周围基质中有大量软骨GAG 基质积聚。T3 组的BMSCs 颗粒显示更明显的陷窝样结构形成（图2B），甲苯胺蓝染色强于对照组，纤维和软骨陷窝较多（图2D）。

图1 T3 组和对照组BMSCs 的MTT 法测定比较

图2 两组BMSCs 颗粒染色

2.3 BMSCs 颗粒在不同条件软骨细胞诱导培养基中的实时定量PCR 表达

甲状腺素实时定量PCR 显示在不同的条件诱导液下BMSCs 的软骨特异基因在体外培养4 周的表达情况（图3）。甲状腺素明显的促进了SOX9，Col-Ⅱ和aggrecan 的表达，差异有统计学意义（SOX9：t=5.741，P=0.001；Col-Ⅱ：t=3.393，P=0.015；aggrecan：t=10.764，P=0.001），但是甲状腺素也促进了软骨细胞肥大相关基因Col-Ⅹ和MMP13 的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）（Col-Ⅹ：t=14.632，P=0.001；MMP13：t=3.417，P=0.014），成骨方向的相关基因RUNX2 和Col-Ⅰ的表达未有明显的增强，两组比较差异无统计学意义（Col-Ⅰ：t=1.739，P=1.133；RUNX2：t=1.924，P=0.103）。

图3 BMSCs 颗粒在不同条件软骨细胞诱导培养基

3 讨论

BMSCs 是软骨组织工程中重要的种子细胞，调控BMSCs 高效向软骨方向分化，分泌软骨特异的细胞外基质，形成外观、化学成分、机械功能与正常软骨相似的组织是目前科研工作的重要课题。TGF-β 超家族是BMSCs 成软骨诱导中最常用的生长因子，包括TGF-β、BMP 等［9］，但是这种诱导方法在以BMSCs 为种子细胞形成的组织工程软骨在功能上尚达不到机体软骨的程度［10］。探索更优化的软骨诱导方案势在必行。甲状腺素是机体内调节生长板软骨生长和骨骼成熟的重要系统内分泌因子，刺激生长板软骨细胞的生长和成熟［11］。本研究在体外以BMSCs 为种子细胞的软骨组织工程中应用甲状腺激素，发现甲状腺素可促进骨髓间充质干细胞的增殖和软骨形成，同时也诱导的软骨细胞肥大相关基因表达。

研究中应用甲状腺素诱导BMSC 细胞向软骨细胞分化的思路来自于临床疾病学和实验动物学的研究：临床上幼儿甲状腺素低下会导致骨软骨发育不全和呆小症状；甲状腺素低下的小鼠会出现骨骺板内软骨细胞增殖层和肥大层细胞减少，导致骺板厚度的降低，补充甲状腺素可以逆转这种生长板的紊乱，而补充生长激素则不能逆转这种紊乱，提示甲状腺素有促进软骨细胞增殖和成熟的作用。生理浓度甲状腺素与核受体结合，进而调控软骨细胞增值和软骨相关基因的表达［12］。甲状腺激素调控BMSC 软骨发生的机制目前仍不清楚，研究发现用甲状腺激素处理的生长板软骨细胞上调了Wnt-4 mRNA 和蛋白的表达，增加了稳定的β-catenin 在细胞内的积累，增加了TCF/LEF 转录活性，并刺激了RUNX2/cbfa1 基因的表达［13］。另有研究显示，联合应用甲状腺素、胰岛素和骨形态发生蛋白2，结果获得更多的软骨细胞。因此推测甲状腺素是通过与胰岛素、骨形态发生蛋白2（BMP2）的信号通路相互作用而发挥诱导作用的，另外一个可能的重要蛋白是BMP6，在应用TGF-β 和地塞米松基础上，联合应用BMP-6可以显著促进hBMSCs 成软骨分化，可使hBMSCs聚集的重量增加10 倍，GAGs 染色更加致密［14］。

在软骨组织工程中，应用BMSC 细胞为种子细胞，向软骨细胞诱导过程中一个关键的问题是软骨细胞的肥大。肥大的软骨细胞的特征是细胞体积增加，细胞外基质钙化，肥大的软骨细胞发生凋亡。肥大型软骨细胞被认为是终末分化的软骨细胞，通过偶联软骨形成和骨形成过程而在骨骼发育中起到过渡的作用［15］。一般情况下认为肥大软骨细胞不可避免的趋向于凋亡，因此软骨组织工程中并希望避免肥大表型在细胞出现。本研究显示，在甲状腺激素诱导BMSC 软骨发生的过程中，虽然软骨特异基因的表达增强了，但是软骨肥大相关基因Col-Ⅹ和MMP13 同时也被诱导增强了。已经知道，以软骨细胞为种子细胞，生理浓度甲状腺素素（0.1～1.0 nmol/L）能够促进软骨细胞肥大分化；但是高浓度的甲状腺素（100 nmol/L）反而抑制了软骨细胞的肥大分化：高于100 nmol/L 的T3 可以明显地抑制软骨细胞体外培养时的去分化和肥大分化，软骨肥大相关基因（Col-Ⅹ，MMP13）的表达均低于常规培养组［16］。以BMSC 为种子细胞，诱导其软骨发生的传统的诱导液包含TGF-β 和地塞米松，这种诱导液可以引起软骨细胞肥大；如果在软骨诱导液中添加生理浓度（1 nmol/L）甲状腺素，则可以进一步明显的诱导软骨细胞肥大，而这种诱导又是通过骨形态发生蛋白4 发挥作用的，BMP 拮抗剂Noggin 可阻断甲状腺素的BMSC 软骨发生的软骨肥大表型增强作用［17］。高浓度的甲状腺素在诱导BMSC 软骨发生的过程中是否能避免软骨细胞肥大表型方面的研究较少。在本研究中，在BMSC 细胞软骨诱导分化中应用高浓度甲状腺素（100 nmol/L），结果显示软骨细胞肥大相关基因的表达增强。种子细胞的不同可能是造成高浓度甲状腺素的作用不同的主要原因，具体机制仍不清楚。研究发现bFGF 和甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）可抑制TGF-β 引起的早期肥大分化［18］；混合共培养发现人软骨细胞分泌的可溶性因子能抑制TGF-β 诱导后的BMSCs 早期肥大分化，其中软骨细胞分泌的胰岛素样生长因子5，胰岛素样生长因子5 可能发挥重要的作用［19］。理想的诱导方案能够同时促进软骨特异基因和蛋白表达，同时不增加软骨细胞肥大表型的表达，更优化的联合诱导方案仍需进一步探索。

综上所述，本研究在诱导骨髓间充质干细胞软骨形成的过程，观察和探索了软骨诱导液中添加甲状腺素对软骨特异基因表达和软骨肥大表型的影响，发现甲状腺素可促进间充质干细胞的增殖和软骨形成，同时也诱导了软骨细胞肥大相关基因的表达增强，这些结果为研究软骨组织工程的诱导方案提供了有益的线索。