外周血单个核细胞TLR4基因表达水平与AS、RA病情活动性的关系分析

钱 臣，徐 扬，蒋逸秋

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)均为临床常见的慢性炎性自身免疫性疾病[1-2]，其具体发病机制均尚未阐明。TOLL样受体4(TOLL-like receptors 4，TLR4)作为参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，是连接非特异性免疫与特异性免疫的桥梁，既往报道[3-4]显示其在慢性免疫性炎症疾病如AS、RA中扮演重要角色。但TLR4在AS、RA病人中的表达是否存在差异或与AS、RA的临床与实验室指标是否存在相关性尚缺乏明确报道。故本文拟测定TLR4基因在AS、RA病人中的表达情况及其与病情活动性、有关实验室指标的关系。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年5月至2017年5月常州市武进人民医院骨科确诊的AS、RA病人各40例，分别为AS组、RA组；另选取30名同期入院体检的健康志愿者为对照组。AS组中，男女性别比为3∶2，年龄28～67(44.92±9.55)岁，体质量指数19～28(24.54±2.27)kg/m2，病程4～9(6.40±1.54)年；RA组中，男女性别比为5∶3，年龄35～70(48.59±10.61)岁，体质量指数19～29(24.66±2.40)kg/m2，病程2～9(5.86±1.69)年；对照组中，男女性别比为3∶2，年龄29～65(45.88±9.75)岁，体质量指数19～28(24.39±3.05)kg/m2。3组性别构成比、年龄、体质量指数差异均无统计学意义(P>0.05)，且AS组和RA组对应病程差异均无统计学意义(P>0.05)。本次研究经我院医学伦理会审核通过。

1.2 对象纳入及排除标准 纳入标准：(1)性别不限，年龄18～70岁；(2)AS、RA组病人符合相关诊断标准[5]；(3)所有研究对象在知情本实验研究的情况下签署知情同意书。排除标准：(1)合并严重的心肝肺肾等重要脏器功能损伤及血液系统疾病；(2)既往长期服用解痉镇痛类药物、糖皮质激素类药物；(3)合并颈胸段后凸畸形或其他原因导致的关节强直，重叠其他风湿性疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征及严重骨关节炎等；(4)合并有感染、其他自身免疫性疾病、严重糖尿病、高血压及严重肝肾疾病；(5)有精神、心理疾病或妊娠、哺乳期妇女。

1.3 病情评估 AS、RA病情活动性分别采用Bath强直性脊柱炎病情活动指数(Bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI)评分[6]、28个关节病情活动指数(disease activity score in 28 joints，DSA28)积分[7-8]评估，其中BASDAI评分≤4分、>4分分别为AS稳定期、活动期；DAS28积分<2.6分、≥2.6分分别为RA稳定期、活动期。

1.4 外周血单个核细胞TLR4 mRNA检测 所有对象抽取空腹静脉血3 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度离心处理提取单个核细胞，调整细胞数为5×109个/升，接种于24孔细胞培养板后置于37 ℃培养箱中培养4 h。取1 mL培养后的细胞悬液，以TRIzol一步法提取总mRNA，并逆转录为cDNA，取等量逆转录产物进行TLR4 mRNA荧光定量PCR测定。反应条件：94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30次循环；72 ℃延伸5 min后，4 ℃ 5 min。引物由大连Takara生物公司设计并合成，引物序列：上游5′-ACT TGG ACC TTT CCA GCA AC-3′，下游5′-TTT AAA TGC ACC TGG TTG GA-3′。取PCR产物置于2%琼脂糖凝胶中，120 V电压电泳30 min。以β-acttin与TLR4的吸光度比值作为TLR4 mRNA的相对表达量。

1.5 实验室指标检测 所有对象另抽取空腹静脉血3 mL，室温静置20 min后进行离心处理，3 000 r/min离心20 min，离心半径15 cm，收集上层血清标本置于-80 ℃冰箱保存统一待测。采用乳胶凝集试验法测定血清类风湿因子(RF)水平，Western法测定血清红细胞沉降率(ESR)水平，速率散射比浊法测定C反应性蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，酶联免疫吸附法测定白介素(Interleukin，IL)-17水平；另采用流式细胞仪检测人白细胞抗原(HLA)-B27，结果在正常范围(0～20%)内为阴性，否则为阳性。

1.6 统计学方法 采用t(或t′)检验、χ2检验、方差分析、q检验和Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 各组外周血单个核细胞TLR4 mRNA比较 外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达水平比较，AS组>RA组>对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 各组外周血单个核细胞TLR4 mRNA比较

2.2 稳定期和活动期病人TLR4 mRNA的差异 AS组病人平均BASDAI评分为(5.10±1.85)分，包括稳定期21例、活动期19例，TLR4 mRNA分别为0.19±0.04、0.26±0.08，差异有统计学意义(t′=3.44，P<0.01)；RA组病人平均DSA28积分为(4.24±0.99)分，包括稳定期14例、活动期26例，TLR4 mRNA分别为0.14±0.03、0.20±0.05，差异有统计学意义(t=4.65，P<0.01)。

2.3 各组实验室指标检测结果比较 RA组血清ESR、RF、CRP、IL-17水平显著高于AS组、对照组(P<0.01)；AS组ESR、CRP、IL-17水平显著高于对照组(P<0.01)，RF与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；AS组HLA-B27阳性率显著高于RA组、对照组；RA组、对照组HLA-B27阳性率差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组实验室指标检测结果比较

2.4 相关性分析 Pearson相关性分析显示，AS组病人中，外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达与BASDAI评分及血清ESR、CRP、IL-17水平呈显著正相关关系(P<0.05～P<0.01)，与RF水平、HLA-B27阳性率无相关性(P>0.05)；RA组病人中，外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达与DSA28积分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平呈正相关关系(P<0.05～P<0.01)(见表3)。

表3 AS及RA病人病情活动性相关实验室指标与外周血单个核细胞TLR4 mRNA的相关性分析

3 讨论

1994年就已在人体细胞中发现了TLRs，其分为胞膜外区、胞质区和跨膜区三部分，是天然免疫系统中具有特异性的一类Ⅰ型跨膜受体及病原模式识别受体。既往报道[9-10]显示，TLRs可识别并结合外源性或内源性配体，组成复合物后活化TLR介导的信号转导通路，诱导细胞分泌IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子及趋化型的细胞因子，发生免疫反应，启动抗微生物防御。TLR4是人类发现的第一个TLRs相关蛋白，最初发现TLR4仅于髓源性细胞(如单核巨噬细胞)上表达，随着研究的深入，许多学者发现心脏、呼吸道上皮细胞和软骨细胞也均有TLR4的表达[11]。此后逐渐有报道论证了TLR4参与了机体多项病理生理过程，尤其在急性炎症反应、细胞信号转导及细胞凋亡中扮演了重要角色。对于慢性自身免疫性疾病而言，TLR4在系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞和滑膜组织中表达显著升高，且其疾病的活动性与TLR4的上调密切相关。近年来，逐渐有学者[12-13]发现TLR4基因表达与AS、RA有关，TLR4主要表达于细胞膜表面，在滑膜细胞细胞中也有表达，可引起持续的炎性细胞激活，从而放大滑膜炎症，加快RA[5]病情进展。国内研究[14-16]中证实LPS/TLR4可激活NF-κB信号途径，诱导炎症反应，继而加重RA，因此TLR4主要通过促进机体炎症反应参与RA的发生发展。

本研究发现AS组、RA组、对照组外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达水平存在明显差异，AS组、RA组活动期病人TLR4 mRNA表达水平显著高于稳定期病人，证实了AS、RA病人外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达明显上调，AS上调尤其显著，并可能与疾病活动性有关。分析原因为，AS肌腱附着点炎症突出、RA滑膜组织炎性增生和炎症细胞浸润显著，最终均可引起关节组织结构的破坏与功能障碍，而且RA的发生发展与T细胞过度活化、B细胞过度刺激引起的大量自身抗体产生有关。TLR4具有跨膜信号转导功能，能够同时介导触发髓样细胞分化因子88的依赖性与非依赖性途径，导致基因编码的促炎细胞因子和趋化因子的激活。还有学者[17-19]认为，AS、RA病人外周血单个核细胞处于活化状态，通过TLR4可启动机体炎症反应，合成和释放炎症因子，最终导致关节组织和骨组织的破坏。此外，肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖等外源性配体可与TLR4结合，增强IL-6、IL-17等促炎细胞因子和趋化因子在AS、RA病人滑膜成纤维细胞和外周血单个核细胞中的表达，继而触发关节软骨的炎症或退化。

本研究结果表明AS组病人外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达与BASDAI评分及血清ESR、CRP、IL-17水平正相关，RA组病人外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达与DSA28积分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平正相关，提示AS、RA病人外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达与病情活动性及炎性指标具有相关性。但TLR4基因影响AS、RA病人病情活动性及炎性反应的具体机制还需进一步深入探讨，相关结论仍需扩大样本量、多中心的研究进一步论证。