陕西浆水菜中分离的发酵乳杆菌及其发酵饮品工艺初探

黄朝 柯远 张娜瑶 晁倩文

浆水菜是我国陕西、甘肃、山西、河南等地的一种传统发酵蔬菜，具有调理肠胃、提高食欲等诸多益生功效。浆水发酵过程包含着复杂的微生物群系，其中最主要的发酵菌群为乳酸菌。随着对乳酸菌研究的不断深入，许多学者发现其具有调整胃肠道菌群平衡、提高食物消化率等功效，因此将其广泛用于发酵食品的加工过程，以此提高食品的品质及风味。

虽然近年来我国科研人员对浆水这一传统发酵食品的研究逐渐深入，但主要集中于对菌群情况的研究，针对浆水中乳酸菌开发新产品的报道并不多见。本研究以陕西西安周边农村为采样地点，从传统发酵浆水中分离筛选出乳酸菌，观察并研究其形态、生长特性，进行乳酸菌的分子生物学鉴定。通过对蕨麻的处理，选用合适的添加比例以及处理方式，从而研制出一款具有保健作用的蕨麻鹰嘴豆乳酸菌饮品。

一、材料与仪器

1.食品原料。市售的蕨麻和鹰嘴豆，白砂糖、三氯蔗糖、α-淀粉酶（购于某公司），以上原辅料均为食品级。乳酸菌菌株：发酵乳杆菌XIMC-9分离自陕西农村的浆水菜，本实验室保存，于2021年5月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.22525;MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司。

2.设備。20L发酵罐、水浴锅、pH计、离心机、超净台、豆浆机、调配罐、包装机、分析天平、显微镜、移液枪、恒温生化培养箱、PCR仪。

二、操作与方法

1.工艺原理。乳酸菌对蕨麻汁、鹰嘴豆豆浆进行发酵，生产出风味独特、营养丰富、具有保健作用的蕨麻鹰嘴豆乳酸菌饮品。

2.工艺流程。原料检验——蕨麻磨浆——酶解离心——添加鹰嘴豆豆浆——配料及标准化——灭菌——冷却——接种——搅拌——保温发酵——调味——灌装——装箱——冷藏——检验——出厂。

3.操作要点。（1）浆水菜乳酸菌的分离与鉴定。①乳酸菌的分离。在无菌操作台取新鲜浆水菜液体10mL，转移至90mL的无菌生理盐水中并混合均匀，依次进行10倍的梯度稀释到1×10-8，用移液枪吸取1×10-6、1×10-7、1×10-8这3个梯度的稀释液各100μL于固体培养基MRS中，每个稀释度平行3个平板。在恒温生化培养箱中倒置平板，在37℃条件下恒温培养48h，挑取表面具备乳酸杆菌特性的菌落，接种到MRS液体培养基中进行扩大培养;重复上述步骤，然后进行革兰氏染色试验镜检，确定革兰氏阳性菌株为纯菌株后，再活化一代。利用这样的方法培养2次，得到在液体培养基中较纯的乳酸菌菌种。把最后得到的乳酸菌菌种放在MRS液体培养基中，放入4℃冰箱保存待用。

②乳酸菌的鉴定。对获得的乳酸菌菌株进行分子鉴定。使用引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT进行PCR扩增，测序由陕西省微生物研究所菌种资源研究中心完成。将基因序列在NCBI上通过BLAST进行比较分析，利用CLUSTALX软件和MEGA3.1软件进行多序列比对，并构建目标菌株与参比菌株之间的系统进化树。

（2）蕨麻的处理工艺及操作要点。①蕨麻汁澄清的工艺流程。挑选直径为5-10mm且相对规则的蕨麻，清洗后浸泡12-14h。使用豆浆机破壁磨浆后用纱布过滤，再由α-淀粉酶催化分解淀粉，然后高速离心，即可获得澄清的蕨麻汁。

②操作要点。把存在病虫害的蕨麻去掉，用干净的水淘洗蕨麻至清澈，热水浸泡12-14h后备用。使用豆浆机破壁磨浆，得到蕨麻浆，用纱布过滤后，将蕨麻的皮渣等滤掉。取已经过滤的蕨麻浆汁，在其中加入一定比例的α-淀粉酶，在水浴锅中恒温水浴，促进淀粉酶得以水解，使淀粉变成支链淀粉。随后利用离心机离心蕨麻液，得到澄清的蕨麻汁。酶解完成后，把蕨麻汁放入发酵罐中进行高温高压灭菌，从而使得α-淀粉酶失活，失去酶解活性。

③酶解试验。在前期试验中，通过运用α-淀粉酶对蕨麻浆进行酶解，进而提升其澄清度，降低蕨麻汁的粘稠度，其中影响澄清度和粘稠度的主要因素包括酶的用量、处理时间及温度等。

（3）鹰嘴豆的处理。把存在病虫害的鹰嘴豆去掉，用干净的水淘洗，热水浸泡12-14h后备用。用豆浆机破壁磨浆，用纱布过滤后，得到鹰嘴豆豆浆。

（4）混合配料。配料主要包括蕨麻、鹰嘴豆，通过单因素水平试验，有效决定最佳配料比。

（5）灭菌要点。将蕨麻汁与鹰嘴豆豆浆、白砂糖按照相应比例置于60℃热水中搅拌溶解，在20L发酵罐中经121℃、0.1Mpa保温保压灭菌10-20min，使其无菌。

（6）接种发酵。在无菌操作条件下，提前将发酵乳杆菌在MRS液体培养基中培养好备用，待物料进入发酵罐中，再将菌种溶液加入发酵罐中。在37-43℃条件下保温发酵24h，在发酵过程中不得开启搅拌。

（7）调味、灭菌、包装。将一定比例的白砂糖和三氯蔗糖溶于热水中，在调配罐中进行61-63℃巴氏消毒15min，随后降温至25℃，加入已经发酵好的蕨麻鹰嘴豆乳酸菌发酵液，在调配罐中搅拌混匀后，将所得饮品在100℃条件下灭菌15-20min，随后在无菌条件下利用包装机进行灌装，得到蕨麻鹰嘴豆乳酸菌饮品。

三、结果与讨论

1.乳酸菌的分离筛选。将陕西农村地区的浆水菜样品稀释后，在37℃条件下培养48h，分离纯化得到一株乳酸菌。由图1可知，其为革兰氏阳性菌，菌体呈长杆或短杆状，符合乳酸菌的形态特征。

测序后利用BLAST将该菌的基因片段序列与GenBank数据库中已知序列进行比对，获得近源物种信息。利用CLUSTALX软件和MEGA3.1软件构建系统进化树，菌株XIMC-9与Lactobacillus fermentum（发酵乳杆菌）亲缘性最近，结果如图2所示。根据菌株的16SrDNA序列比对结果，确定浆水乳酸菌XIMC-9为发酵乳杆菌。

2.蕨麻浆的酶解澄清度单因素试验。首先，加酶量对蕨麻浆的澄清度和粘稠度有一定的影响，一般加酶量以0.1%为最佳。其次，酶解时间也对蕨麻浆的澄清度和粘稠度有一定的影响，由试验结果可知酶解最佳时间为3-4h，在水浴锅中酶解温度为60℃。

3.蕨麻汁和鹰嘴豆豆浆的比例试验。以活菌数为主要考核指标，同时参考感官评定。单因素梯度分别为：蕨麻汁与鹰嘴豆豆浆的配比（质量比）1：2（1）、1：3（2）、1：4（3）、1：5（4），发酵乳杆菌添加量为1%，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，结果如图3所示。不同的蕨麻汁与鹰嘴豆豆浆的配比对乳酸菌活菌数有所影响，固定其它因素，可得出原料最佳配比为1：4，乳酸菌活菌数最高为5×108，且感官评分最高。

四、结论

目前国内对蕨麻的开发利用较少，本次试验以蕨麻混合鹰嘴豆豆浆，添加陕西浆水菜分离的发酵乳杆菌XIMC-9进行发酵后再灭菌包装，生产出具有保健作用的蕨麻鹰嘴豆乳酸菌饮品，可以给蕨麻原料的开发利用提供一些参考价值。

作者简介：黄朝（1993-），男，生物工程硕士研究生，西安国际医学生物技术有限公司研发工程师，主要研究方向为微生物与食品工程。