循环长链非编码RNA作为肿瘤诊断标志物的研究进展△

李梦仙，方哲伟，王俊玲，熊倩，杨锦四，李宏伟

曲靖市第一人民医院检验中心，云南 曲靖 655000

肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一，迅速增长的肿瘤发病率和病死率使全球癌症控制更加刻不容缓。传统生物标志物，如甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）及糖类抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）等的诊断效果不甚理想。由于缺乏有效的诊断方法，多数患者就诊时已进展至晚期，错过了最佳的救治时机。随着分子研究的不断深入，一些在肿瘤组织中特异性表达的基因逐渐引起了临床的重视。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等生物学功能中的调控作用已被证实，lncRNA表达失调与肿瘤发生发展密切相关[1-3]。但由于检测组织中lncRNA的表达取材较为困难，且无法连续检测肿瘤动态变化等，因此，寻求简易无创的检测方法变得极为迫切。研究表明，lncRNA可在人体血清或血浆等多种体液中稳定表达[4]，在多种肿瘤患者血清或血浆中异常表达[5]。表明循环lncRNA与肿瘤的发生发展密切相关，具有成为肿瘤潜在诊断标志物的强大潜力。本文就近年来循环lncRNA作为诊断标志物在肺癌、胃癌、结直肠癌中的研究进展进行综述。

1 肺癌

肺癌是全球人类肿瘤相关死亡的主要原因之一[6]。在尚未出现明显症状的早期阶段发现肺癌，能有效降低患者的病死率。生物标志物对肿瘤的早期诊断有较高的应用价值[7]，因此，找到合适的肿瘤标志物是肿瘤研究的主要目标之一。

lncRNA肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）作为一个被广泛认知的原癌基因，已被证实在乳腺癌、前列腺癌、肝癌及结肠癌等多种肿瘤中表达上调[8]。关于非小细胞肺癌的研究发现，血液中MALAT1的表达水平升高与TNM分期和淋巴转移密切相关。MALAT1已被评估为非小细胞肺癌诊断和预后评估的候选血液生物标志物[9]。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线显示，血清MALAT1诊断肺癌的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.703，灵敏度为60%，特异度为80%，表明MALAT1有望成为肺癌诊断的血清肿瘤标志物。随后的研究发现，MALAT1在淋巴结转移阳性和TNM分期为晚期的肺癌患者血清中表达水平显著升高，提示患者可能预后不良。同时还发现，MALAT1在肺癌患者血清与石蜡包埋组织中的表达水平均高于非肺癌对照组。此外，体外细胞实验发现，MALAT1有诱导肿瘤细胞生长、迁移的作用，进一步说明MALAT1与肺癌的发生发展密切相关[10]。表明MALAT1作为非小细胞肺癌的诊断标志物和治疗新靶点均可能有良好的应用前景。

Liang等[11]对肺癌组织的研究发现，lncRNA生长抑制特异性转录本5（growth arrest specific 5，GAS5）在肺癌组织中低表达，上调肺癌细胞中GAS5的表达可明显促进肺癌细胞凋亡，且GAS5的表达与肿瘤大小及TNM分期有关。表明GAS5可参与调控肺癌进展，有潜力成为肺癌的诊断标志物和预后预测指标。因此，Liang等[11]对90例肺癌患者和33例健康对照者进行检测发现，肺癌患者血浆和肿瘤组织中GAS5的表达水平明显低于健康对照者；且其表达水平仅与TNM分期有关，与年龄、性别、吸烟情况、肿瘤大小、淋巴结转移及组织学类型均无相关性；此外，术后患者血浆GAS5的水平明显高于术前。表明检测血浆GAS5水平可以评估肿瘤动态。ROC曲线分析显示，GAS5诊断肺癌的特异度和灵敏度分别为72.7%和82.2%，均高于CEA的64.8%和51.1%；GAS5、CEA联合检测能有效提高肺癌诊断的特异度和灵敏度，分别为90.9%和86.7%。以上研究均表明，血浆GAS5水平有成为肺癌无创诊断标志物的潜力[11]。

Wan等[12]研究纳入73例肺腺癌患者、51例肺鳞状细胞癌患者和51例健康对照者，检测三组受试者血浆lncRNA前列腺癌相关转录物6（prostate cancer associated transcript 6，PCAT6）水平，ROC曲线显示，血浆PCAT6诊断肺腺癌的AUC为0.921（95%CI：0.866～0.976），诊断肺鳞状细胞癌的AUC为0.958（95%CI：0.911～1.000），均明显高于此前报道的 GAS5（AUC=0.832，95%CI：0.754～0.893）、CEA（AUC=0.700，95%CI：0.611～0.779）诊断肺癌的AUC；PCAT6鉴别肺腺癌与健康对照者的灵敏度、特异度分别为87.67%、97.44%，鉴别肺鳞状细胞癌与健康对照者的灵敏度和特异度分别为94.12%、100%，均高于GAS5+CEA联合检测诊断肺癌的86.70%、90.90%。表明血浆PCAT6是一种有潜力的非小细胞肺癌的非侵袭性诊断标志物，甚至比既往报道的生物标志物的临床应用价值可能更好。

目前，肺癌的临床诊断主要依赖于影像学检查（CT或低剂量CT）和传统血液肿瘤标志物[13]，但假阳性率较高，容易造成过度诊断，增加患者的心理压力，且常年检查积累的辐射也会损害患者的健康。传统肿瘤标志物灵敏度和特异度不高，因此高灵敏度和特异度的血清标志物对非小细胞肺癌的诊断具有重要意义。在肿瘤诊断的应用上，液体活检比传统成像和传统活检具有更高的灵敏度和特异度[14-15]。所以肿瘤来源的循环lncRNA检测对于肿瘤诊断尤其是非侵袭性肿瘤及肿瘤动态监测具有重要意义。

2 胃癌

血浆或血清中的循环lncRNA已成为非侵入性诊断的一个新兴领域，但诊断早期胃癌的循环lncRNA的研究仍较少。lncRNA H19作为最早被报道在多种肿瘤中高表达的基因之一[16]，在胃癌患者血浆中稳定高表达[17]。Zhou等[18]基于以往研究报道，检测8个在胃癌中表达失调的lncRNA在70例胃癌患者肿瘤组织和血浆、70例健康对照者血浆中的表达水平，同时经过室温孵育、RNA酶处理验证稳定性后发现，只有HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、H19在胃癌患者肿瘤组织及血浆中表达上调；进一步检测20例胃癌患者的血浆发现，仅有H19的表达不受外周血细胞的影响；此外，ROC曲线发现，H19诊断胃癌的AUC为0.838，特异度和灵敏度分别为72.9%和82.9%。H19在胃癌患者血浆中的表达情况符合理想肿瘤标志物的特点，即取材方便、经济有效、可重复且准确度高。该研究还发现，同一患者血浆H19水平在术前明显高于术后，提示H19的血浆浓度反映了肿瘤动态，可作为一种新的血浆生物标志物监测肿瘤状态。Hashad等[19]研究同样发现，lncRNA H19在胃癌患者血浆中稳定高表达，且与CEA联合诊断的效果更佳，即H19联合CEA诊断胃癌的AUC为0.804，高于H19单独诊断的0.724。由此可见，H19在胃癌患者血浆中稳定高表达，是对胃癌有强大诊断潜力的血清标志物。

此外，Li等[20]分别检测了胃癌患者、胃上皮异常增生患者及健康对照者血浆lncRNA LINC00152的水平，结果显示，胃癌患者血浆LINC00152水平明显高于胃上皮异常增生患者及健康对照者；血浆LINC00152诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为48.1%和85.2%，特异度明显高于CEA和糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）单独检测（特异度分别为30.0%、42.0%）；随后该研究比较了同一患者血浆中的LINC00152水平和从相同体积的血浆中分离出来的外泌体中的LINC00152水平，结果显示二者并无差异。表明血浆中LINC00152主要存在于外泌体中，外泌体是保护血浆LINC00152稳定表达的主要因素，进一步说明血浆LINC00152有作为胃癌诊断生物标志物的潜力。

Rui等[21]检测126例胃癌患者和120例健康者血清发现，循环lncRNA HOXA远端转录反义RNA（HOXA distal transcript antisense RNA，HOTTIP）在胃癌患者中表达水平明显高于健康者，且HOTTIP水平与肿瘤浸润深度及TNM分期均呈正相关；ROC曲线显示，HOTTIP诊断胃癌的AUC为0.827，明显高于 CEA、CA19-9、糖类抗原 72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）单独检测的AUC，分别为0.653、0.685和0.639，且HOTTIP与CEA、CA19-9、CA72-4联合检测时诊断价值也优于各指标单独检测（HOTTIP与CEA、CA19-9、CA72-4联合检测时，AUC为 0.870）；此外，Kaplan-Meier分析显示，HOTTIP水平升高与胃癌患者的总生存率较低相关。由此可见，循环lncRNA HOTTIP可能是胃癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，尽管胃癌的病死率居全球所有恶性肿瘤第二位，但早期诊断、早期治疗能明显改善患者的预后[22]。体液中的生物标志物具有早期辅助诊断肿瘤的潜在能力，而传统的CEA、CA19-9等胃癌标志物的灵敏度和特异度均较低[23]。从目前的研究来看，这些新型血清生物标志物与传统生物标志物联合应用能有效提高诊断效能，寻求灵敏度和特异度均较高的肿瘤标志物对胃癌的诊断十分重要。

3 结直肠癌

目前，临床结肠癌的诊断主要依赖结肠镜检查和血清肿瘤标志物CEA检测[24]，但结肠镜检查是有创检查且应用不方便，还可能引起其他并发症，而CEA则在肿瘤早期表现出较低的诊断灵敏度和特异度。越来越多的研究致力于发现新的结肠癌特异性诊断标志物。lncRNA结直肠肿瘤差异表达基因-h（colorectal neoplasia differentially expressed-h，CRNDE-h）的表达不仅具有组织特异性，同时还有时空差异性[25]，即CRNDE-h在人类早期发育中高表达，在成年人组织中低表达甚至不表达。由于从疑似结肠癌患者中获得组织较为困难，所以尽管Liu等[26]既往的研究发现，CRNDE-h在结肠癌组织中高表达且其高表达与肿瘤体积增大、区域淋巴结转移及远处转移等显著相关，但CRNDE-h能否作为结肠癌无创且灵敏度和特异度均较高的生物标志物仍有待研究。Liu等[27]后续研究发现，lncRNA CRNDE-h水平在结直肠癌患者血清中显著升高，能有效区分结直肠癌与良性结直肠疾病，且其在血清中的含量不受RNA酶消化的影响；ROC曲线显示，CRNDE-h诊断结直肠癌的特异度为94.4%，灵敏度为70.3%，诊断效能明显优于CEA单独检测（特异度为88.75%，灵敏度为37.16%）；多因素Cox回归模型分析表明，血清CRNDE-h是结直肠癌患者预后的独立影响因素，与经典的影响因素如远处转移、淋巴结转移和CEA水平一样。由此可见，血清CRNDE-h首次发现并被证实符合肿瘤标志物的关键特征，即无创、灵敏度高、特异度高且具有稳定性。

4 小结与展望

在精准医疗的大背景下，以循环lncRNA为代表的无创检测方法正逐步进入人们视线。其与组织活检相比具有创伤小、患者痛苦小等优点，与传统肿瘤标志物相比具有更高的灵敏度和特异度，有望成为肿瘤诊断的新型生物标志物[28]。有益于临床应用的肿瘤生物标志物应能够在容易获得的体液中准确检测到，如血清、唾液或尿液等[29]。目前经典的传统肿瘤标志物检测与肿瘤分期、病理类型相关，是肿瘤负荷的标志物[30]，临床分期越晚阳性率越高，临床检测到时，疾病往往已进展至晚期，错过了最佳的诊断和治疗时机，且传统肿瘤标志物临床应用的特异度不高，如CEA是首个被应用于肿瘤诊断的癌胚蛋白，但CEA在血液中异常表达对区分结肠癌和一般恶性肿瘤不具有特异性[31]。除与其他肿瘤（包括胰腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和睾丸癌）相关外，CEA在肝硬化、炎症性肠病、慢性肺病和胰腺炎等良性病变中的表达水平也会升高。诊断标志物应具备较高的特异度以避免假阳性，导致患者受到不必要的干预及心理压力。

从手术切除的肿瘤组织中进行肿瘤标志物检测，虽然能直观反映其在肿瘤中的表达情况，但由于取材困难及无法对疾病动态连续监测等，临床应用仍存在一定的局限性[32]。循环lncRNA检测在肿瘤中有几个潜在的临床应用：①筛查和早期诊断；②评估手术或非手术治疗的有效性；③随访期间监测复发[33]。循环lncRNA作为肿瘤诊断的无创血清标志物有着广阔的应用前景。多项研究显示，循环lncRNA来源于被脂质双分子层稳定包裹的外泌体[34-36]，保证了其在体液中稳定表达，且外泌体作为细胞间信息传递的载体，可调控肿瘤的发生发展过程[37]，检测外泌体的包含物对肿瘤的诊断及监测均有重要意义。就目前的研究来看，尚未找到针对特定肿瘤类型的特异性循环lncRNA指标，如MALAT1不仅是非小细胞肺癌的候选血清诊断标志物，同时与前列腺特异性生物标志物——前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）联合使用可以在保持高灵敏度的同时提高前列腺癌的检测特异度[38]。此外，对于血浆中哪种提取和检测方法适合lncRNA、哪种分子最适合作为内源性对照，目前还没有被广泛认可的统一共识。由此不难看出，虽然循环lncRNA可以在多种肿瘤患者血清中检测到，且具有一定的诊断价值，但在临床上广泛应用还有待进一步研究探索。