功能性聚氨酯表面层层自组装透明质酸和胶原

何显运，徐勇军，原波

(广东工贸职业技术学院，广州 510510)

可降解聚氨酯(PUR)材料一般由软段和硬段构成，可以通过改变软硬段的构成和比例，对PUR分子进行设计，从而实现对材料性能、降解方式和降解速率的调控[1–2]。PUR材料己经被应用到血管、神经、软骨等组织修复中[3–5]。但和其他合成高分子材料一样，PUR材料由于亲水性，细胞黏附性较差，缺乏细胞识别信号位点，即生物相容性不是很好，所以其在生物医用方面的应用受到较大的限制。为了改善其生物相容性，通常的方法是对材料的表面进行仿生修饰，在材料表面接枝或者沉积细胞外基质成分，在保留PUR优异力学性能的同时，又能提高其生物相容性[6–13]。Hsieh等[14]开发了一种可生物降解的水性PUR/透明质酸3D打印墨水，且3D打印制备了复合软骨组织工程支架，与大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)共培养，结果表明该成分能诱导MSCs成软骨分化，将该支架植入兔膝盖软骨缺损模型可诱导兔软骨再生。Lukas等[15]采用聚碳酸酯二醇制备了PUR，并用等离子体技术进行表面处理，接枝上肝素，纤连蛋白、多肽等生物大分子，能明显改善内皮细胞的黏附与增殖，同时能够抑制血栓的形成。Kawamoto等[16]利用等离子体技术处理PUR材料管的内表面，将牛内皮细胞种植在PUR管的内表面，改善了材料的血液相容性，且促进了内皮细胞的黏附和增殖。Fang等[17]制备了可生物降解PUR弹性体，通过用马来酰亚胺修饰的多肽成功接枝在静电纺丝的PUR材料上，改善了内皮细胞的黏附。Duy等[18]在静电PUR纳米纤维上通过自组装氧化石墨烯(R-GO)，制备了可拉伸化学响应性的纳米复合物PUR/R-GO，该复合物对NO2具有出色的灵敏度，为可穿戴化学传感的应用提供了良好的基础。笔者以自制的功能性PUR为基体，该PUR是以赖氨酸二异氰酸乙酯为硬段，聚己内酯为软段，具有药理活性的异山梨醇为扩链剂，利用二步逐步合成的一种脂肪族可生物降解的聚合物，且降解产物呈弱碱性，没有毒性或者毒性很小，支持细胞的生长和增殖[19]。通过胺解作用，在PUR材料表面接枝上氨基(—NH2)，再利用带负电的透明质酸(HA)和带正电的胶原(Col)，通过静电作用，层层自组装(LBL)沉积到材料表面，既尽量保留了HA和Col的生物活性，又达到了对PUR材料表面的生物活性修饰，期望制得的表面修饰化PUR材料能够应用于组织工程支架。用自组装方法在PUR材料表面沉积上透明质酸和胶原的研究，国内尚未见报道。

1 实验部分

1.1 主要原料及试剂

PUR：自制；

1，3-二氨基丙烷：生物试剂级，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

Ⅰ型Col：生物试剂级，美国BD bioscience公司；

HA：生物试剂级，美国Sigma公司；

茚三酮：分析纯，广州齐云生物试剂有限公司。

1.2 主要设备及仪器

真空干燥箱：DZF-6050型，上海一恒科学仪器有限公司；

表面接触角分析仪：OCA20型，德国DATAPHYSICS公司；

石英微晶天平(QCM)：Q-SenseE4型，瑞典Q-Sense公司；

原子力显微镜(AFM)：MFP-3D-S型，美国Asylum Research公司。

1.3 实验过程

(1) PUR膜的制备。

将自制的PUR用少量的四氢呋喃溶剂进行溶解，倒入到聚四氟乙烯模具中，形成薄薄的一层溶液，然后转到40℃的鼓风干燥箱中，静置24 h，让溶剂慢慢挥发，最后转入温度为30℃真空干燥箱中至恒重，制得PUR薄膜。

(2)氨基化PUR膜(PUR-NH2)的制备。

将上述制备的PUR膜在乙醇/水溶液(体积比1∶1)中浸泡一段时间，再用去离子水漂洗，完后用一定浓度的1，3-二氨基丙烷溶液进行处理，然后再用去离子水充分漂洗以去除未反应的1，3-二氨基丙烷，最后转到温度为30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2膜。图1是PUR膜与1，3-二氨基丙烷反应的示意图。

图1 PUR膜与1，3-二氨基丙烷反应示意图

(3) PUR-NH2膜层层自组装HA和Col。

将上述制得的PUR-NH2膜用0.012 mol/L的盐酸溶液进行酸化处理，接着用大量去离子水冲洗以去除表面吸附的盐酸，然后将其浸泡到HA溶液中，使其表面吸附一层HA，再浸泡到Col溶液中，使其吸附一层Col，如此反复，使其层层沉积上HA和Col，最后转到温度为30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2/HA/Col膜。图2是PUR-NH2自组装HA/Col的过程示意图。

图2 PUR-NH2自组装HA/Col过程示意图

1.4 性能测试

采用表面接触角分析仪测试PUR膜的亲水性情况。

采用茚三酮分析法定量测试PUR膜表面接枝—NH2的密度。

采用QCM检测在PUR膜表面上自组装HA/Col的情况。

采用AFM观察PUR自组装HA/Col后的表面形貌。

2 结果与讨论

2.1 材料表面水接触角

为表征材料表面的亲水性能，通过接触角测量仪测试材料的亲、疏水接触角。表1是PUR，PURNH2和PUR-NH2/HA/Col三种膜测试得到的水接触角。PUR膜接触角为(86.5±1.1)°，接触角较大，表示亲水性能不够好；PUR膜通过氨基化后得到的PUR-NH2的 接 触 角 下 降 到(78.8±0.8)°，说 明PUR-NH2的亲水性能变好；而通过在PUR-NH2表面自组装得到的PUR-NH2/HA/Col的接触角降到(65.5±1.1)°，材料的表面亲水性能得到明显改善。其原因是在PUR-NH2表面沉积上HA和Col，使得该膜表面富集了大量的极性基团，从而使材料的亲水性能变好。而材料的亲水性能变好，有利于细胞的黏附，改善细胞跟材料的亲和力，提高材料的生物相容性。

表1 PUR、PUR-NH2和PUR/HA/Col膜的水接触角 (°)

2.2 茚三酮分析法测试PUR-NH2膜表面的—NH2密度

采用茚三酮分析法对PUR-NH2膜表面—NH2密度进行定量分析。图3是用1，3-二氨基丙烷水溶液(9%)浸泡PUR膜，PUR膜表面—NH2密度与浸泡时间的关系曲线。PUR-NH2膜表面—NH2密度开始随浸泡时间增加而增大，当接近2 h时，PUR膜表面—NH2密度达到最大值，而随着浸泡时间继续延长，PUR膜表面—NH2的密度有所下降。其原因是PUR膜浸泡在1，3-二氨基丙烷中，发生胺解反应，随着时间的增加，接枝在PUR膜表面的—NH2量增，相应的—NH2密度也增大，但随着处理的时间继续增加，胺解反应会使材料的表层脱离，从而使接枝上的—NH2从材料表面脱落，相应的—NH2密度也就下降。

图3 PUR膜表面—NH2密度与浸泡时间的关系曲线

图4是PUR-NH2膜表面的—NH2密度随浸泡的1，3-二氨基丙烷水溶液浓度不同而变化的曲线。由图4可以看到，浸泡时间同为1 h，1，3-二氨基丙烷浓度为12%时，PUR膜的—NH2密度最大，为11.4×10-7mol/cm2。假设—NH2只接枝在PUR膜表面，由此计算得到含一个—NH2的分子链所占的面积约为0.00014 nm2。这个计算结果显然是不合理的，说明PUR膜的胺解反应不是单纯发生在PUR膜的表面一层，而深入到膜的里层。

图4 PUR膜表面—NH2密度与浸泡水溶液浓度的关系曲线

2.3 QCM检测PUR—NH2膜表面上LBL自组装HA/Col

为了监测PUR—NH2膜表面层层自组装HA/Col的过程，采用QCM进行检测。图5是PURNH2膜表面自组装HA/Col时金片振动频率(F)和耗散因子(D)随时间的变化曲线图。

图5 金片F和D的变化曲线图

从图5可以看到，随着HA溶液和Col溶液的通入，F不断降低，而D则不断增大。其原因就是由于HA和Col通过静电作用吸附在金片上，从而使金片的质量增大，相应的振荡频率也就减小，而耗散因子则相应地增大。由此说明HA和Col沉积在PUR-NH2膜上。

2.4 AFM观察PUR膜和PUR自组装HA/Col膜的表面形貌

图6是采用AFM扫描得到的PUR膜和PURNH2膜自组装HA/Col的表面形貌图。从图6可以看到，单纯的PUR膜表面相对比较光滑；而沉积了HA和Col的PUR-NH2膜，表面覆盖了一层物质，表面看起来比较粗燥，有比较多的小突起，大小在纳米级，而这样的一个表面纳米结构应该有利于细胞的粘附，从而改善材料的生物相容性。文献[20]报道了用浓NaOH溶液处理PLGA工程支架，使支架表面形成粗糙的纳米结构，用这样的支架培养细胞，能够明显促进细胞的增殖和分化。因此，通过在PUR材料表面自组装上HA和Col，从表面形貌上可以得到这样的一个纳米表面结构，从而达到改善材料的生物相容性。

图6 PUR膜和PUR-NH2膜自组装HA/Col表面形貌图

3 结论

以功能PUR为基体，在1，3-二氨基丙烷的作用下，在PUR材料的表面引入—NH2，然后在材料的表面通过静电作用机制层层自组装上HA和Col。茚三酮分析法测试结果表面PUR膜成功接枝上了—NH2。QCM和AFM测试结果表明HA和Col组装在PUR—NH2膜的表面。沉积在PUR—NH2膜上的HA和Col，使材料的亲水性能得到改善，同时在材料表面形成一个粗糙的纳米形貌结构。通过这样的表面仿生修饰，将有利于细胞的粘附及促进细胞的增殖和分化，为该PUR材料应用于组织支架奠定基础。