QuEChERS结合UPLC-MS/MS法测定茵栀黄口服液中14种农药残留

李 媛， 王 娟， 张 楠， 谢志民

(西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054)

茵栀黄口服液收载于2015年版《中国药典》，处方由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩提取物和金银花提取物[1]组成，具有清热解毒，利湿退黄的功能。其中栀子、黄芩、金银花商品药材主要为种植产品。据文献报道[2]，花和果实类药材、部分多年生根和根茎类药材农药残留污染比较严重，尤其是花类药材检出率最高。部分农药残留直接危害人体健康。本品经常用于新生儿黄疸的治疗中，控制农药残留尤为重要。本实验选取上述栀子[3]、黄芩[4]、金银花[5-9]药材可能使用及常用的农药，结合已有文献报道[10]检出的农药种类，拟对啶虫脒、仲丁威、敌百虫、毒死蜱、吡虫啉、灭幼脲、辛硫磷、乐果、托布津、甲基托布津、克百威、吡蚜酮、敌敌畏、马拉硫磷14种农药采用液-质联用方法进行测定，作为茵栀黄口服液安全性的质量控制方法之一。

1 材料

1.1 仪器 岛津LC-30 AD型超高效液相色谱仪；LCMS 8060三重四极杆质谱仪，LabSolutions工作站；岛津Shim-pack GIST C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2 μm)。

1.2 试剂 乙腈(色谱纯，德国Fisher公司)；甲酸、乙酸(色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司)；氯化钠、无水硫酸镁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；PSA，GCB(分析纯，天津博纳艾杰尔公司)。啶虫脒对照品(批号201905，含量100 μg/mL)由农业部环境保护科研检测所提供；仲丁威(批号G170133，纯度98.4%)、吡蚜酮(批号G832819，纯度97.8%)、托布津(批号G980847，纯度97.7%)、毒死蜱(批号G130559， 纯度99.8%)对照品均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供；敌百虫(批号M3H1，含量100 μg/mL)、吡虫啉(批号A3X1，含量100 μg/mL)、灭幼脲(批号1901，含量100 μg/mL)、辛硫磷(批号N222，含量100 μg/mL)、乐果(批号1901，含量100 μg/mL)、甲基托布津(批号1902，含量100 μg/mL)、克百威(批号A3Z1，含量100 μg/mL)、敌敌畏(批号J3X2，含量100 μg/mL)、马拉硫磷(批号M3H2，含量100 μg/mL)对照品均由北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司提供。

1.3 药物 32批茵栀黄口服液和6批茵栀黄注射液、黄芩提取物(A35190111004)、栀子提取物(T181004)和金银花提取物(T181201)均购自北京华润高科天然药物有限公司。低、中、高质量浓度空白茵栀黄口服液样品为本实验室自制，不含待测农药。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 精密量取茵栀黄口服液(批号20181206)10 mL[注射液(批号171023A1)20 mL]，置于50 mL离心管中，加入0.1%乙酸乙腈10 mL(注射液20 mL)，涡旋混匀1 min，加入氯化钠1 g(注射液2 g)、无水硫酸镁4 g(注射液8 g)，涡旋混匀1 min，3 500 r/min离心5 min，精密量取上清液2 mL(注射液4 mL)，加入无水硫酸镁300 mg(注射液600 mg)、PSA 100 mg(注射液200 mg)、GCB 20 mg(注射液40 mg)，涡旋混匀1 min，3 500 r/min离心5 min，精密量取上清液1 mL，减压浓缩至干，乙腈∶水(3∶2)定容至1 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。同法制备仅含黄芩提取物模拟样品(A35190111004)、仅含栀子提取物模拟样品(T181004)、仅含金银花提取物模拟样品(T181201)的供试品溶液。

2.2 对照品溶液制备 精密称取/量取各对照品适量，乙腈-水(3∶2)制成每1 mL分别含托布津14 ng、吡蚜酮13 ng、仲丁威8 ng、毒死蜱5 ng、克百威2 ng、乐果1 ng、辛硫磷2 ng、敌百虫4 ng、吡虫啉10 ng、啶虫脒10 ng、甲基托布津12 ng、马拉硫磷40 ng、灭幼脲65 ng、敌敌畏40 ng的溶液，摇匀，即得。取空白茵栀黄口服液样品，按“2.1”项下方法处理，作为空白基质，制备基质匹配对照品溶液，见图1。

1.吡蚜酮 2.敌百虫 3.吡虫啉 4.乐果 5.啶虫脒6.敌敌畏 7.甲基托布津 8.克百威 9.托布津 10.仲丁威11.马拉硫磷 12.灭幼脲 13.辛硫磷 14.毒死蜱图1 各农药TIC色谱图

2.3 分析条件

2.3.1 色谱 Shim-pack GIST C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)；流动相 0.1%甲酸(A)- 乙腈(B)，梯度洗脱(0～1 min，95% A；1～4 min，95%～70% A；4～7 min，70%～50% A；7～15 min，50%～30% A；15～20 min，30%～5% A)；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

2.3.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，灭幼脲采用负离子模式(ESI-)，其余均采用正离子模式(ESI+)；多反应检测(MRM)模型，参数见表1；雾化气体积流量3 L/min；加热气体积流量10 L/min；干燥气体积流量10 L/min；接口温度300 ℃；DL温度250 ℃；加热块温度400 ℃。

2.3.3 监测离子选择 采用Scan模式，以m/z150～400进行扫描，确定保留时间并进行分段采集，MS参数见表1。

表1 各农药MS参数

2.4 基质效应 分别以各农药峰面积、对照品系列质量浓度绘制基质对照曲线、溶剂对照曲线，通过对比两者斜率来考察基质效应[11-12](ME)，公式为ME=A/B×100%，其中A为目标成分在基质匹配对照品溶液中标准曲线的斜率，B为目标成分在系列对照品溶液中标准曲线的斜率，ME>100%表示呈基质增强效应，ME<100%表示呈基质减弱效应，ME>150%表示呈显著的基质增强效应。精密量取低、中、高质量浓度空白茵栀黄口服液，按“2.1”项下方法处理后加同一质量浓度对照品溶液准确定容，得到基质，在“2.3”项条件下进样测定，结果见表2。由此可知，14种农药均存在不同程度的基质效应，基质浓度越大，对各农药的影响越强，其中毒死蜱、马拉硫磷等大部分农药呈基质抑制效应，而敌敌畏呈显著的基质增强效应。为了减少基质效应对检测结果的影响，本实验采用空白基质配制对照品溶液。

表2 各农药基质效应测定结果(%)

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 用基质匹配的对照品溶液逐级稀释，制得农药对照品溶液，在“2.3”项条件下进样测定，以各农药质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，以信噪比(S/N)=10时为定量限，结果见表3，可知各农药在各自范围内线性关系良好。

2.5.2 重复性试验 精密量取茵栀黄口服液(批号20181206)10 mL，以5 μg/L水平添加，按“2.1”项下方法处理，平行检测6次，RSD<10%，重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 分别于0、1、4、8、12、16、20、24 h精密吸取重复性考察项同一供试品溶液，以5 μg/L水平添加，按“2.1”项下步骤进行前处理，在“2.3”项条件下进样测定，测得各农药峰面积RSD均≤10%，表明农药残留在24 h内稳定性良好。

2.5.4 准确度、精密度试验 向空白基质品中添加低、中、高质量浓度(1、5、10 μg/L)农药对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，平行3份，在“2.3”项条件下进样测定，结果见表4。

2.6 农药残留测定 6批茵栀黄注射液均未检测到14种农药，而32批茵栀黄口服液均检测到啶虫脒、吡虫啉，含量分别为在4.7～7.9、8.0～14.6 μg/L范围内。虽均未超出安全限度，但应引起关注，特别是婴幼儿制剂尤为重要。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件及样品制备方法考察 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水流动相系统及不同浓度甲酸的效果，结果乙腈-0.1%甲酸水为最佳条件。样品提取过程中比较酸性乙腈、丙酮和乙酸乙酯对于目标农药的提取效果，结果显示酸性乙腈提取效率较高且杂质较少，故选择酸性乙腈作为提取溶剂。样品中有大量色素杂质, 且辅料中含蜂蜜、蔗糖等杂质，净化采用PSA、GCB及无水硫酸镁组合。PSA吸附剂清除样品中的脂肪酸、亲脂性色素和糖类等极性成分进行分散固相萃取，GCB用于除去样品中的色素杂质，无水硫酸镁吸取多余的水分，最后根据回收率情况与净化效果优化无水硫酸镁、PSA、GCB的用量。

表3 各农药线性关系

表4 空白样品加样回收试验结果(n=3)

3.2 基质效应 由基质效应表可以看出，大部分农药为基质抑制作用，推测可能是由于与被分析物一起流出的其他内源性物质(如盐类、胺类、脂肪酸、甘油酸酯等)造成的。这些物质与分析物共同流出喷雾针，对电荷产生竞争，改变了带电雾滴的表面张力，影响分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，致使进入质谱的离子减少[13]。由表2看出敌百虫、辛硫磷基质效应较为强烈，分析其原因可能是由于其含有极性的及强氢键的结构P=O、-N=等基团，含有此类结构化合物通常具有较为严重的基质效应。

3.3 农药残留分析 国标中啶虫脒的ADI为0.07 mg/kg，欧盟标准为0.025 mg/kg；国标中吡虫啉的ADI为0.06 mg/kg，按照2015年版《中国药典》四部9302中药中有害残留物限量制定指导原则计算，得茵栀黄口服液中啶虫脒的最大限量为1.4 μg/mL、吡虫啉的最大限量为1.2 μg/mL。按照欧盟标准计算啶虫脒的最大限量为0.5 μg/mL。结果32批口服液均未超出限度范围，注射液未检出，分析可能由于工艺影响。同时在金银花提取物检出克百威、啶虫脒和吡虫啉，黄芩提取物检出辛硫磷，栀子提取物未检出农药残留，茵陈多为野生，故不作考虑。茵栀黄口服液中的农药残留来自于处方中的金银花提取物，应关注金银花的农药残留情况。