HPLC法同时测定四逆散中8种成分

2022-02-25贾可可陈闪闪许美娟杨欣怡邹建东居文政

中成药 2022年2期

贾可可，陈闪闪,2，许美娟，杨欣怡,2，邹建东，居文政*

[1.南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)，江苏南京 210029；2.南京中医药大学，江苏南京 210029]

经典方剂四逆散最早记载于《伤寒论》，由甘草、白芍、枳实、柴胡组成，具有调和肝脾、透邪解郁、疏肝理脾之功效，可用于治疗抑郁症[1]。为了最大程度保留经方特色，关于四逆散的体内外成分分析和药效学实验大多在遵循传统的基础上选择水煎煮提取，前期研究结果也表明该方水煎液具有抗抑郁作用[2-3]。目前，对四逆散的成分研究集中在定性分析[4-5]和少量成分的定量分析上[6-8]，其质量标准尚未完全制定，缺乏多指标成分含量的同时测定。因此，本实验采用HPLC法同时测定四逆散中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素的含量，以期完善该方质量控制标准，并为后续抗抑郁物质基础研究提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent HP1100型高效液相色谱系统，配置紫外检测器(可变波长型)、色谱仪专用工作站等；Millipore Q-A10型超纯水仪；CPA225D型电子天平；Thermo micro 17R型高速冷冻离心机；KH5200E型超声波清洗器。

1.2 试剂与药物柴胡、白芍(炒)、枳实(麸炒)、甘草(炙)均购自江苏省中医院，经江苏省中医院药学部副主任药师张倩鉴定为正品。没食子酸(批号MUST-17022801，纯度99.04%)、芍药内酯苷(批号MUST-18041601，纯度99.14%)、芍药苷(批号MUST-18032901，纯度99.30%)、橙皮苷(批号MUST-16041806，纯度99.70%)、槲皮素(批号MUST-19101104，纯度99.35%)、甘草酸(批号MUST-16070805，纯度98.36%)对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司；柠檬苦素(批号110800，纯度99.91%)对照品购自中国食品药品检定研究院；川陈皮素(批号BWB50625，纯度98%)对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司。色谱纯甲醇、乙腈购于德国默克公司；分析纯磷酸购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液准确称取各对照品适量，甲醇超声溶解后定容，制成没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素质量浓度分别为500、500、1 000、400、50、500、250、50 μg/mL的贮备液，分别精密吸取91.1、91.1、153.8、170.9、68.3、91.1、121.5、68.3 μL，溶解定容至1 mL，即得(各成分质量浓度分别为45.55、45.55、153.80、68.36、3.42、45.55、30.38、3.42 μg/mL)。

2.1.2 供试品溶液称取相应量柴胡、白芍、枳实、甘草(比例1∶1∶1∶1)，加入8倍量蒸馏水浸泡0.5 h后煎煮0.5 h，8层纱布粗滤得水煎液，残余药渣再加入6倍量蒸馏水煎煮0.5 h，8层纱布粗滤得水煎液，合并水煎液，纱布过滤，续滤液浓缩蒸发至浸膏状，即得四逆散浸膏(得率29%)，低温保存备用。称取1 g，溶于25 mL 20%甲醇中，混合均匀，超声提取30 min至完全溶解，12 000×g离心2次，每次5 min，取上清，制成40.0 mg/mL溶液(以浸膏计)，即得(生药量137.9 mg/mL)。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脱(0～6 min，2%～15%A；6～13 min，15%～17%A；13～22 min，17%～25%A；22～28 min，25%～33%A；28～38 min，33%～50%A；38～41 min，50%A；41～42 min，50%～2%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL；检测波长240 nm(0～36 min，没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸)、210 nm(36～42 min，柠檬苦素、川陈皮素)。取供试品(稀释5倍)、对照品(稀释2.25倍)溶液适量，在上述色谱条件下进样，结果见图1，可知各成分与相邻峰均能有效分离。

1.没食子酸 2.芍药内酯苷 3.芍药苷 4.橙皮苷 5.槲皮素 6.甘草酸 7.柠檬苦素 8.川陈皮素1.gallic acid 2.albiflorin 3.paeoniflorin 4.hesperidin5.quercetin 6.glycyrrhizic acid 7.limonin 8. nobiletin图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密吸取对照品溶液适量，20%甲醇梯度稀释成7个质量浓度(稀释因子1.5)，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，其峰面积积分值为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验精密吸取对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素峰面积RSD分别为0.71%、0.27%、0.67%、0.56%、0.89%、0.47%、0.78%、0.60%，保留时间RSD分别为0.28%、0.57%、0.66%、0.33%、0.13%、0.08%、0.06%、0.06%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液，置于棕色进样小瓶中，于0、2、4、6、8、12、24、48 h在“2.2”项色谱条件下各进样10 μL测定，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素峰面积RSD分别为2.12%、2.09%、0.94%、2.25%、2.35%、1.18%、1.34%、1.29%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验取同一批药材适量，制成浸膏后按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素含量RSD分别为1.95%、0.71%、0.88%、1.16%、1.49%、0.18%、0.28%、0.15%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验取各成分含量已知的浸膏，精密加入对照品(加入量与浸膏中相应成分含量的比值约为1∶1)，按“2.1.2”项下方法平行制备3份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下各进样10 μL测定，计算回收率。结果，没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、柠檬苦素、川陈皮素平均加样回收率分别为100.12%、94.78%、98.04%、99.32%、94.21%、96.62%、95.74%、95.96%，RSD分别为2.41%、0.56%、1.61%、0.76%、1.21%、1.37%、0.61%、2.14%。

2.3.6 样品含量测定取同一批药材适量，制成浸膏后按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表2。由此可知，芍药苷、甘草酸含量符合2020年版《中国药典》[9]规定(分别不低于1.2%、1.0%)。

表2 各成分含量测定结果(mg/g生药，n=6)

3 讨论

结合前期实验和文献[10-11]报道，本实验首先考察流动相甲醇-水(含0.05%磷酸)、[甲醇-乙腈(1∶1)]-水(含0.05%磷酸)、乙腈-水(含0.05%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)，发现以乙腈-水(含0.1%磷酸)洗脱时色谱效果最优。再考察柱温35、40 ℃，发现在35 ℃下各成分色谱峰峰形较好，与相邻峰之间几乎无干扰。然后考察检测波长210、240、280、320 nm，发现在240 nm处各成分色谱峰峰形、分离度、响应值较好，基线平稳，故确定为“2.2”项下色谱条件。

在2020年《中国药典》中，枳实、甘草、柴胡质控成分分别为辛弗林、甘草苷和甘草酸、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D[9]。文献[12]报道，柴胡皂苷A、柴胡皂苷D在煎煮提取过程中易发生开环转化，而本实验发现两者含量很低，难以定量。同时，本实验还分别用辛弗林、甘草苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品与供试品比较，发现供试品中含有辛弗林，但其极性较大，难以保留；含有甘草苷，但甘草苷、芦丁难以分离；在检测波长范围内未发现柚皮苷；新橙皮苷含量较低，难以定量；文献[13]也证实，柚皮苷、新橙皮苷在283 nm波长处吸收较强。本实验为了兼顾其他成分，未同步检测以上化合物，还有待于后续进一步完善。

有学者采用UHPLC-QqQ-MS法测定四逆散中16种成分含量[14]，而本实验采用传统的HPLC法测定8种成分含量，相比前期报道的4种[6-8]和课题组之前测定的6种[10]，在数量上有了一定突破。研究表明，没食子酸[15]、芍药内酯苷[16]、芍药苷[17]、橙皮苷[18]、槲皮素[19]、甘草酸[20]、柠檬苦素[21]、川陈皮素[22]均有抗抑郁活性，故本实验选择上述成分作为含量测定指标。