氯喹联合125I粒子用于裸鼠肝细胞癌移植瘤

杨崇双，肖云华，梁清华，黄学全，何 闯，邓良余，熊俊儒，刘平平

(陆军军医大学西南医院核医学科，重庆 400038)

放射性125I粒子植入是局部连续低剂量放射治疗(放疗)肿瘤手段，具有安全、微创、可重复等优点[1-2]，诱导细胞凋亡是其杀伤肿瘤的主要机制；但125I粒子还可引起肿瘤细胞保护性自噬而降低抑瘤作用[3-4]，而氯喹(chloroquine, CQ)可抑制125I粒子诱导细胞自噬[4-5]。125I粒子可抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞异位移植瘤血管生成[6]。本研究观察CQ联合125I粒子对裸鼠HCC Hep3B细胞移植瘤的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 24只健康雄性BALB/c裸鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK(湘)-2019-0004]，4～6周龄，体质量20～24 g。本研究获陆军军医大学伦理委员会批准(AMUWEC20200407)。

1.2 主要试剂与仪器 HCC细胞株Hep3B(美国ATCC)，放射性125I 粒子(北京智博高科技生物技术)活度0.8 mCi，硫酸羟氯喹(上海上药中西制药)，LC3抗体及CD31抗体(美国CST)；血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、促血管生成素2(angiopoietin 2, Ang2)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(北京正四柏生物科技)，实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)试剂盒(艾科瑞生物科技)，TUNEL凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液及BCA试剂盒(碧云天生物技术)；联影uCT510 CT扫描仪。

1.3 模型构建 常规培养Hep3B细胞，并于裸鼠右侧腹股沟皮下注射约1×107个细胞，2周后皮下移植瘤体积为200～250 mm3，即模型构建成功。从中挑选移植瘤大小接近的20只，移植瘤平均体积为(226.43±14.61)mm3，随机分为CQ组、125I粒子组(I-125组)、CQ联合125I粒子组(CQ+I-125组)及正常对照(normal control, NC)组，每组5只。对CQ组每日腹腔注射CQ 50 mg/kg体质量，连续注射14天；对I-125组于CT引导下将1枚125I 粒子植入移植瘤中(图1)；对CQ+I-125组于CT引导下将1枚125I 粒子植入移植瘤中，并连续14天腹腔注射CQ 50 mg/kg体质量；对NC组不作处理。分笼饲养I-125组及CQ+I-125组裸鼠。21天后处死裸鼠，取移植瘤称重，并安全回收125I粒子。

1.4 检测细胞凋亡 以4%多聚甲醛固定移植瘤组织，之后行石蜡包埋及切片；按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书方法及步骤进行实验后，于光镜下观察肿瘤细胞凋亡情况并拍照记录。

1.5 检测LC3、CD31表达及计算微血管密度(microvessel density, MVD) 对石蜡切片行二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，以0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液沸煮抗原修复、3%H2O2阻断内源酶活性、5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液封闭，于4℃冰箱孵育一抗(CD31、LC3，1∶100)过夜；采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤切片后孵育二抗，行二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色、苏木精复染，以中性树胶封片。于光镜下观察并以Weidner法[7]计算移植瘤MVD：于低倍镜下寻找微血管密集区后，转换高倍镜(×400)，随机选取3处视野，记录其高倍镜下微血管数目，以3处平均值为MVD。

1.6 检测VEGF-A及Ang2的mRNA表达 采用Trizol提取移植瘤组织总RNA，并将其反转录成cDNA；以cDNA为模板进行RT-PCR，按试剂盒说明书要求设置反应体系及反应条件，引物由Genecopoeia公司设计合成；最后以2-ΔΔCT相对定量法计算基因相对表达量。

1.7 检测VEGF、Ang2蛋白表达 以RIPA裂解液提取移植瘤组织样品蛋白，以BCA试剂盒检测蛋白浓度，并将其调至相同浓度；在酶标包被板上设标准品孔及实验孔，向其内分别加入100 μl不同浓度标准品蛋白及待测蛋白样品，置于37℃孵育1.5 h后洗板，加入生物素化抗体工作液100 μl，置于37℃孵育1 h后，加入100 μl酶结合物工作液，再置于37℃孵育0.5 h；加入100 μl显色剂，避光反应15 min后加入100 μl终止液，以酶标仪检测各孔450 nm处光密度(optical density, OD)，计算待测样品蛋白浓度。

1.8 统计学分析 采用GraphPad prism 6.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，采用独立样本t检验行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植瘤质量 CQ组、I-125组、CQ+I-125组及NC组移植瘤质量分别为(0.56±0.05)、(0.41±0.04)、(0.31±0.02)及(0.81±0.07)g。CQ组移植瘤质量大于I-125组及CQ+I-125组(t=4.91，P<0.01；t=9.91，P<0.01)而小于NC组(t=6.08，P<0.01)；I-125组移植瘤质量大于CQ+I-125组(t=5.49，P<0.01)而小于NC组(t=10.65，P<0.01)；CQ+I-125组移植瘤质量小于NC组(t=14.93，P<0.01)，见图2。

2.2 细胞凋亡和LC3表达 光镜下CQ组、I-125组、CQ+I-125组及NC组移植瘤组织内均存在凋亡细胞及LC3阳性表达；细胞凋亡数量从多到少依次为CQ+I-125组、I-125组、CQ组及NC组，LC3表达从高到低依次为I-125组、CQ+I-125组、CQ组及NC组，或I-125组、CQ+I-125组、NC组及CQ组(NC组与CQ组基本相同)，见图3。

2.3 MVD 光镜下CQ组、I-125组、CQ+I-125组及NC组移植瘤组织内均存在CD31阳性表达，移植瘤MVD分别为(13.61±1.84)、(11.89±2.21)、(5.13±1.23)及(19.50±2.12)个/高倍视野。移植瘤MVD在CQ组与I-125组差异无统计学意义(t=1.68，P=0.13)，在CQ组及I-125组均大于CQ+I-125组(t=12.45，P<0.01；t=7.85，P<0.01)而小于NC组(t=5.06，P<0.01；t=6.04，P<0.01)，在CQ+I-125组则小于NC组(t=15.07，P<0.01)，见图4。

2.4 VEGF-A和Ang2的mRNA相对表达量 CQ组、I-125组、CQ+I-125组及NC组移植瘤VEGF-A的mRNA相对表达量分别为0.89±0.05、0.66±0.10、0.52±0.09及1，Ang2的mRNA相对表达量分别为0.83±0.07、0.66±0.08、0.46±0.06及1。移植瘤VEGF-A和Ang2的mRNA相对表达量在CQ组高于I-125组(t=3.70，P=0.02；t=2.92，P=0.04)及CQ+I-125组(t=5.85，P<0.01；t=6.91，P<0.01)而低于NC组(t=3.61，P=0.02；t=4.19，P<0.05)，在I-125组高于CQ+I-125组(t=2.64，P<0.05；t=3.20，P=0.03)而低于NC组(t=5.81，P<0.01；t=7.67，P<0.01)，在CQ+I-125组则低于NC组(t=8.10，P<0.01；t=11.87，P<0.01)。见图5。

2.5 VEGF-A和Ang2蛋白表达量 CQ组、I-125组、CQ+I-125组及NC组VEGF-A蛋白表达量分别为 (1 092.00±80.60)、(895.70±79.87)、(672.5±75.49)及(1 370.00±60.89)pg/ml，Ang2蛋白表达量分别为(978.80±119.00)、(840.40±55.41)、(730.50±58.11)及(1 126.00±128.50)pg/ml。其中，CQ组移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表达量高于I-125组(t=3.47，P<0.05；t=2.58，P<0.05)及CQ+I-125组(t=7.60，P<0.01；t=4.55，P<0.01)，低于NC组(t=5.50，P<0.01；t=2.55，P<0.05)；I-125组移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表达量高于CQ+I-125组(t=4.06，P<0.01；t=3.35，P<0.01)，低于NC组(t=9.45，P<0.01；t=5.00，P<0.01)；CQ+I-125组移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表达量低于NC组(t=14.38，P<0.01；t=6.87，P<0.01)。见图6。

3 讨论

HCC是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高[8]；超过70%患者获得确诊时已处于中晚期[9]，错过手术治疗最佳时期。放射性125I粒子植入有助于改善中晚期HCC患者生活质量并延长生存时间[10]，但由于放疗抵抗，患者自单纯125I粒子植入治疗中获益有限。

CQ为抗疟药，主要用于防治疟疾及自身免疫性疾病；同时具有诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖及自噬等作用[11]，主要通过抑制放射及化学治疗(放化疗)诱导自噬而增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性、提高其抑瘤作用[2,12]，常作为自噬抑制剂用于抗肿瘤研究。WANG等[3]发现，以125I联合CQ治疗食管癌，癌细胞死亡数量明显多于单独125I粒子治疗，提示CQ有助于增强125I粒子的放疗作用。本研究中，CQ+I-125组移植瘤重量明显低于I-125组及CQ组，但凋亡细胞数量多于I-125组及CQ组，且标志自噬发生的重要分子标记物LC3在I-125组和CQ+I-125组的表达明显高于NC组，而I-125组则高于CQ+I-125组，与既往针对食管鳞癌的研究[4]结果基本一致，表明CQ可抑制125I粒子诱导自噬而增强其抑瘤作用。

肿瘤发生、发展除与肿瘤细胞增殖、凋亡及自噬有关外，还与肿瘤新生血管密切相关；文献[7]报道无明显新生血管生成时，肿瘤最大体积为2～3 mm3。LI等[13]发现，CQ组肺癌裸鼠移植瘤模型的移植瘤体积、重量和MVD均明显低于对照组。XIANG等[14]认为125I粒子植入可明显降低肺癌移植瘤组织中的MVD。研究[12]表明，多柔比星联合CQ的抗血管生成作用高于单独多柔比星；CQ及125I粒子均可降低移植瘤组织的MVD[13,15]。此外，肿瘤微血管生成还受肿瘤微环境中多种细胞因子调控。VEGF和Ang2是目前已知最主要的两类促血管新生因子，且具有协同作用；抑制Ang2表达可明显抑制肿瘤血管生成[16]。相比邻近肝组织，HCC的VEGF-A及Ang2表达明显升高，且与肿瘤恶性程度和患者预后密切相关[17-18]。LI等[13]认为CQ可下调人脐静脉内皮细胞Ang2，从而抑制血管生成。SCHAAF等[19]发现CQ还可抵消VEGF诱导的血管生成效应。本研究亦发现CQ与125I粒子可协同作用，降低HCC移植瘤MVD及VEGF-A和Ang2的表达。

综上，CQ联合125I粒子可协同抑制裸鼠HCC移植瘤生长，对其相关分子机制、联合治疗最佳剂量及给药时间均有待进一步观察。