血清miR-429作为胰腺癌潜在诊断生物标志物的价值研究

黄文涛 邱福南

胰腺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，胰腺癌的中位生存期是3～6 个月，其5年生存率小于5%[1，2]。尽管手术技术和药物治疗有所改进，但临床效果仍不显著。据统计，世界范围内胰腺癌发病率和死亡率分别为4.2%和4.0%。研究表明，胰腺癌患者从癌症起始细胞到转移性癌症亚克隆平均需要17年左右，且在约2.7年后死亡[3，4]。胰腺癌的早期诊治有助于延长患者的预后生存时间[5，6]。因此，筛选、鉴定胰腺癌诊断的分子标志物对于提高胰腺癌患者的生存率具有重要作用。

miR-429 是miR-200 家族成员，在各种肿瘤中差异表达，且与肿瘤进展密切相关。肾癌患者的miR-429 表达水平显著升高，并且过表达miR-429可以显著增加肾癌细胞增殖并显著降低细胞凋亡率[7]。另外有研究将miR-429 鉴定为卵巢癌的驱动因子，综合生物信息分析和血清表达检测实验均显示miR-429 在卵巢癌中过度表达[8]。然而，有些研究结果表明miR-429 在一些肿瘤中表达下调并充当肿瘤抑制因子，如miR-429 通过靶向调控胃癌中的Myc（V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog) 及FSCN1 （Fascin actin-bundling protein 1）、口腔鳞状细胞癌中的ZEB1 （Zinc finger E-box binding homeo-box 1）及肝细胞癌中的CRKL （V-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like）、TLN1（Talin 1）发挥抑癌作用[9]。然而miR-429 在胰腺癌中的研究鲜有报道，本研究主要分析miR-429 在胰腺癌患者中的表达及其是否可以充当胰腺癌诊断的血清检测分子标志物，同时对其在胰腺癌中的潜在作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 公共数据库胰腺癌miRNAs 表达数据的提取从癌症基因图谱（TCGA）及基因表达谱（GEO）数据库GSE71533、GSE24279 及GSE41369 提取miR-429 的表达及临床信息。TCGA 数据下载自http://www.cbioportal.org/data_sets.jsp，GEO 数据下载自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。

1.2 临床样本采集采集2015年6月1日～2018年5月30日在我院治疗的、经病理证实的50 例胰腺癌患者的癌组织及癌旁组织，以及30 例胰腺癌患者血清样本及30 例健康者血清样本。纳入标准：①18～80 岁；②ECOG-PS 为0～1 分；③手术切除为主要治疗方法；④经组织学或细胞学确诊为胰腺癌。在手术期间收集非肿瘤和肿瘤标本，相邻非肿瘤与癌组织边界之间的距离约为1cm。排除标准：①同时患有其他恶性肿瘤者；②严重的、无法控制的医疗状况者；③患有严重精神疾病者。本研究获得我院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言的规则。患者在研究开始前均签署了书面知情同意书。

1.3 miRNA 提取及荧光定量PCR本研究使用RNAiso for Small RNA 试剂盒（Takara，日本）提取组织和细胞的miRNAs。miRNAs 通过Mir-X™miRNA 第一链合成试剂盒（Takara，日本）转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix 试剂盒（Applied Biosystems，美国）检测miR-429 的表达。RT-qPCR的扩增条件为：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环；95℃ 60s，55℃ 1min，95℃ 30s。Mir-X™miRNA第一链合成试剂盒中包含miRNA反义引物。U6 用作对照。引物序列如下所示：miR-429 Sense primer TAATACTGTCTGGTAAAACCGT，U6 Sense primer CTCGCTTCGGCAGCACA。

1.4 分析采用的网站及R 包使用pheatmap 包绘制表达相关系数热图，使用Targetscan 网站（http://www.targetscan.org/）分析miR-429 的靶基因。韦恩图的绘制采用 jvenn 网站（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），利 用DAVID 网站（https://david.ncifcrf.gov/）对目标基因进行KEGG-pathway 及GO-BP 分析。

1.5 统计学分析本研究采用SPSS 22.0 统计学软件进行分析，miR-429 在50 对胰腺癌组织及其相应的癌旁组织的差异分析采用配对t检验，miR-429 在胰腺癌患者血清及健康者血清中的差异分析采用非配对t检验。生存分析采用log-rank test 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-429 在胰腺癌患者组织中的表达情况GSE71533 数据集分析显示miR-429 在胰腺癌组织中的表达显著低于癌旁组织（P＜0.001），见图1。TCGA 数据集分析显示miR-429 高表达的胰腺癌患者总生存时间显著优于miR-429 低表达的患者[P=0.04，HR=0.65，95%CI（0.43,0.98）]，见图2。

图1 miR-429 在GSE71533 数据集胰腺癌中的表达

图2 miR-429 在TCGA 胰腺癌数据集中的预后分析

miR-429 在50 例胰腺癌患者癌组织中的表达显著低于癌旁组织（P＜0.01），见图3A。高表达患者的miR-429 总生存时间显著优于低表达患者[P=0.02，HR=0.44，95%CI（0.21,0.89）]，见图3B。

图3 miR-429 在50 对胰腺癌与癌旁组织中的表达及预后分析

2.2 miR-429 在胰腺癌患者血清中的表达通过GSE24279 数据集检测136 例胰腺癌患者及22 例健康者血清中miR-429 的表达，结果显示与健康者相比，胰腺癌患者血清中miR-429 的表达显著降低（P＜0.01），AUC 为0.683，见图4。

图4 miR-429 在GSE24279 数据集中胰腺癌患者血清中的表达

通过检测30 例胰腺癌患者和30 例健康者血清中miR-429 的表达，结果显示胰腺癌患者血清中miR-429 的表达相较于健康者显著下调（P＜0.01），AUC 为0.833，说明miR-429 是胰腺癌的有效诊断指标，见图5。

图5 miR-429 在胰腺癌患者血清中的表达

2.3 miR-429 在胰腺癌中的潜在靶基因及下游信号通路分析为了进一步分析miR-429 在胰腺癌的作用机制，我们分析了GSE41369 数据集中配对的胰腺癌组织中与miR-429 表达呈负相关的基因，结果显示与miR-429 表达呈负相关的基因有699 个（r＜-0.5）。通过Targetscan 数据库分析了miR-429 潜在的靶基因，结果显示miR-429 潜在的靶基因有1 190 个。韦恩图显示两者之间交集有156 个基因。对这些基因进行KEGG-pathway 及GO 分析，KEGG-pathway分析结果显示这些差异基因富集在磷脂酶D 信号通路、感染人类T 细胞白血病病毒1、系统磷脂酰肌醇信号等通路；GO-BP 分析结果显示这些差异基因富集在细胞过程负调控、细胞发育过程、细胞分化、细胞代谢过程负调控等信号通路，见图6。

图6 胰腺癌中miR-429 潜在靶基因及下游信号通路分析

3 讨论

胰腺癌的发生发展与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关，研究胰腺癌中差异表达的分子即可为胰腺癌的治疗提供分子靶点。miRNAs 广泛存在于真核细胞中，miRNAs 主要通过靶向靶基因的表达进而影响肿瘤细胞的进展。

miR-200 家族成员miR-429 的失调参与了各种癌症的进展。miR-429 在肾母细胞瘤、甲状腺癌、骨肉瘤、多形性胶质母细胞瘤和胃癌中表达水平降低。在肾透明细胞癌中，miR-429 通过靶向VEGF 抑制细胞增殖和迁移、诱导细胞凋亡从而发挥肿瘤抑制作用[10]；在甲状腺癌中，miR-429 在甲状腺癌组织和细胞系中表达下调。在甲状腺癌细胞中转染 miR-429 可显著抑制细胞增殖、迁移和入侵。此外，ZEB1被鉴定为 miR-429 的靶基因[11]；在骨肉瘤中，miR-429 在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中表达下调，miR-429 通过调控HOXA9 表达抑制骨肉瘤细胞增殖及侵袭[12]；在多形性胶质母细胞瘤中，miR-429通过调控SOX2 表达，进而抑制细胞增殖及侵袭[13]。另一方面，miR-429 在结直肠癌和前列腺癌中的表达增加。在结直肠癌中，miR-429 通过直接调控LATS2 表达并促进结直肠癌增殖及侵袭[14]；在前列腺癌中，miR-429 通过调控p27Kip1 表达并促进细胞增殖[15]。

在本研究中，我们发现与癌旁组织相比，胰腺癌组织中miR-429 的表达显著下调。同时，与健康者相比，胰腺癌患者血清中miR-429 水平降低，表明 miR-429 可能作为胰腺癌的血清诊断标志物。通过表达相关性及靶基因预测分析，我们发现在胰腺癌组织中miR-429 的表达可能调控多个靶基因，这些靶基因富集在磷脂酶D 信号通路、感染人类T细胞白血病病毒1、系统磷脂酰肌醇信号通路、细胞过程负调控、细胞发育过程、细胞分化、细胞发育、细胞代谢过程负调控等信号通路。

综上，miR-429 在胰腺癌患者组织和血清中的表达均显著降低，miR-429 高表达是胰腺癌患者的有利预后因素，miR-429 是胰腺癌血清诊断的有效指标。miR-429 可能成为胰腺癌诊断及治疗的新分子靶点，但其具体的作用机制仍有待深入探究。