白三烯B4受体在寻常型银屑病表皮中的表达

张 巍,涂晓娟, 杨祎娜, 舒 心

银屑病是一种由免疫介导的慢性、复发性的常见皮肤炎性反应性疾病，寻常型银屑病是最常见的类型。银屑病常罹患终身，皮损为局限或广泛分布的鳞屑性红斑及斑块，发作期伴有剧烈的瘙痒、灼热等症状，药物治疗不能完全缓解，严重影响患者的生活质量和精神状况。银屑病的病因和发病机制复杂，至今尚未完全阐明。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)来源于花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，是一种重要的炎性反应介质，BLT1和BLT2是目前已被鉴定的两种LTB4受体。多项研究表明，LTB4参与了银屑病的炎性反应和增殖过程。LTB4的炎性反应作用必须通过与特异性受体结合才能实现。本研究旨在通过免疫组织化学方法检测BLT1和BLT2在寻常型银屑病皮损表皮中的表达强度，探讨白三烯B4受体(BLT1和BLT2)在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达情况，为寻找临床治疗新靶点提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2014-11-01至2018-10-31在我院皮肤科行常规组织病理检查，并保存完整的寻常型银屑病石蜡组织标本30例为银屑病组。选取30例在整形外科行手术切除患者的正常皮肤为对照组。所有患者均于术前1个月无全身性用药史，术前2周取材部位皮肤无局部用药。排除标准：(1)妊娠期、哺乳期；(2)严重感染性疾病、红斑狼疮等自身免疫性疾病；(3)恶性肿瘤、肝肾疾病及其他严重疾病者。银屑病组男18例，女12例，平均(40.85±6.48)岁，病程6个月～18年。对照组男20例，女10例，平均(38.75±9.46)岁。两组患者性别和年龄上差异无统计学意义(>0.05)，具有可比性。所有患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 主要试剂 兔抗人白三烯B4受体(BLT1和BLT2)多克隆抗体均为上海雅吉生物科技有限公司产品，SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂均为北京中杉生物有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 石蜡组织标本 两组皮肤组织均采用10%的甲醛溶液固定，后经脱水、透明、石蜡包埋等处理制作成石蜡组织标本，编号备用。

1.3.2 免疫组织化学法检测 免疫组织化学染色采用链霉素-生物素过氧化物酶(S-P)三步法检测BLT1和BLT2的表达。操作过程严格按照产品说明书进行。石蜡组织标本经修整后用切片机连续切片，厚度为5 μm，置于温水中展开，采用聚赖氨酸处理过的载玻片捞片，置于65 ℃干燥箱中烤片2 h。二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.01 M枸椽酸盐缓冲液(pH6.0)高压锅修复，3%HO孵育,灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清进行封闭，滴加兔抗人BLT1、BLT2多克隆抗体，浓度为1∶200，4 ℃冰箱过夜。滴加二抗(生物素化山羊抗兔抗体工作液)，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每次实验均设阴性对照和阳性对照。BLT1和BLT2表达阳性表现为光镜下胞浆出现淡黄色至棕黄色颗粒。阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，阳性对照为白三烯B4受体表达阳性的胰腺癌石蜡切片。

1.3.3 免疫组化BLT1和BLT2的光密度值分析 高倍显微镜下BLT1和BLT2表达阳性染色表现为棕黄色颗粒。采用Image-Pro Plus6.0软件系统对免疫组化图像进行半定量分析。按照随机抽样原则，在光学显微镜200倍视野下每张切分别摄取5个视野，测量每个视野阳性染色区域的平均光密度(AIOD)值，测量范围是皮肤表皮基底层与角质层之间的区域，并求其平均值。以平均光密度值反映BLT1和BLT2的表达强度，平均光密度值越高，表达强度越大，反之亦然。全部图片的采集及分析均由同一名操作人员完成。

2 结 果

2.1 免疫组化染色结果 BLT1和BLT2在银屑病组和对照组皮肤组织中均有不同程度的表达，阳性着色部位主要是表皮角质形成细胞的胞浆，呈淡黄色至黄褐色颗粒，胞核未见明显表达。(1)皮肤组织中BLT1的免疫组化染色结果：银屑病组皮损组织表皮中，BLT1主要表达于棘层下部(图1A)。对照组皮肤组织中，BLT1主要表达于基底层(图1B)。(2)皮肤组织中BLT2的免疫组化染色结果：在银屑病组皮损组织表皮中，BLT2在棘层中呈高表达，在基底层无表达或极少表达(图1C)。对照组皮肤组织中，BLT2主要表达于基底层(图1D)。

图1 BLT1和BLT2在银屑病皮损和正常皮肤表皮中的表达(SP，×400)A. BLT1在银屑病皮损表皮棘层下部呈高表达；B.BLT1在正常人皮肤表皮基底层中表达为阳性；C.BLT2在银屑病皮损表皮棘层中呈高表达；D.BLT2在正常人皮肤表皮基底层中表达为阳性

2.2 BLT1和BLT2表达强度比较 根据皮肤表皮组织中表达强度的平均光密度值统计分析结果显示，与对照组平均光密度(128.29±6.16)相比，BLT1在银屑病组平均光密度(144.82±17.75)显著上调，差异有统计学意义(=2.838，=0.008)；BLT2在银屑病组皮损中平均光密度(141.75±16.72)，明显高于对照组(127.54±5.19)，差异有统计学意义(=2.604，=0.002)。

3 讨 论

银屑病是一种增殖过度性疾病，而这种增殖是由一系列复杂的炎性反应介质驱动的，主要与中性粒细胞、树突状细胞和Th17细胞介导的Th17免疫有关。表皮增生、中性粒细胞等炎性细胞浸润、血管扩张是银屑病的特征性组织学特征。中性粒细胞通常在角化不全病灶的正上方，中性粒细胞微脓肿通常在角质层的多个层次出现，通常位于角化不良小病灶的顶部，角化不全与中性粒细胞交替出现呈现“三明治征”。

LTB4是花生四烯酸在白细胞中经5-脂氧化酶代谢的活性产物之一，是重要的炎性反应介质，对白细胞(尤其是中性粒细胞)有强烈的趋化作用，可以使白细胞向炎性反应聚集，还可激活白细胞产生超氧产物，释放炎性反应因子。有研究发现，LTB4可导致银屑病早期皮损中大量中性粒细胞侵入表皮形成典型的微脓肿；LTB4还可抑制表皮细胞cAMP的生成，可能参与了银屑病表皮角质形成细胞的过度增殖；银屑病患者的皮损处LTB4浓度与银屑病皮损面积与严重性指数(PASI)评分有显著相关性。这些研究均表明，LTB4在银屑病的发生和发展中发挥了重要的作用。因此，减少LTB4的生成、加快LTB4的清除、阻断LTB4与其受体结合或可成为银屑病治疗的新靶点。

BLT1是LTB4特异性的高亲和性受体，除粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞，还在1型辅助性T细胞(Th1)、2型辅助T细胞(Th2)、17型辅助T细胞(Th17)、效应CD8+T细胞、树突状细胞(DCs)和破骨细胞中表达。在咪喹莫特诱导的银屑病模型中，中性粒细胞中的LTB4-BLT1信号通过与CXCL1/2趋化因子受体CXCR2协同作用，显著加速了中性粒细胞在皮肤中的浸润，并促进了银屑病皮炎的发展。除了对中性粒细胞的影响外，LTB4还通过BLT1作用于皮肤树突状细胞和γδT细胞，促进其迁移和/或细胞因子的产生，这也促进了银屑病皮炎的进展。BLT2是一种低亲和性受体，但表达更为广泛，这些受体通过介导LTB4的活性，参与宿主免疫应答和炎性反应疾病的发病机制。马聪等通过外源性LTB4刺激小鼠体外诱导培养DCs，证明BLT2通路是LTB4介导的DCs趋化的关键通路，参与LTB4介导的 DCs TNF-α和IL-lβ的释放。

本研究通过免疫组织化学的实验方法检测了BLT在银屑病患者皮损处及正常人皮肤表皮组织中的表达情况，结果发现，BLT1和BLT2在银屑病患者和正常对照皮肤表皮中均可见表皮角质形成细胞的胞浆，呈淡黄色至黄褐色颗粒，但BLT1和BLT2在表皮中的分布与正常皮肤不同，表达强度较正常对照皮肤明显上调。这与文献[15，16]的研究结果相似。在本实验中，BLT1、BLT2在正常皮肤组织表皮中主要表达于基底层，提示二者在健康机体中参与重要的生理活动，维持正常的细胞周期。在寻常型银屑病皮损组织表皮中BLT1和BLT2在棘层呈高表达，由此推测BLT1和BLT2可能参与了角质形成细胞异常增殖和分化、炎性反应细胞的趋化聚集。其中，BLT1主要表达于棘层下1/3，推测导致角质形成细胞的过度增殖及异常凋亡可能存在于棘层下部。由此本研究从病理学角度解释了银屑病皮损棘层全层角质形成细胞异常增殖及分化，但BLT1和BLT2在银屑病棘层的表达分布模式值得进一步研究分析。

综上所述，LTB4在寻常型银屑病的发病机制中发挥着重要作用，在银屑病皮损组织表皮中LTB4浓度升高，且皮损棘层中BLT1和BLT2高表达。LTB4通过其受体(BLT1和BLT2)发挥作用，诱导炎性反应细胞在皮损处聚集浸润，参与角质形成细胞的异常增殖和分化，从而导致寻常型银屑病皮损的产生。使用LTB4拮抗剂有望通过阻断LTB4与受体结合从而减轻银屑病炎性反应和表皮的过度增殖，这一治疗方法有待进一步通过实验来证实。