食品中蛋白质含量测定方法的研究进展

颜李秀 周邦萌 苏琳 李瑜

食品可以给人们提供各种各样的营养物质，其中，蛋白质是保证人体正常新陈代谢的重要化合物之一，豆类、花生、肉、乳、蛋和鱼虾等都含有丰富的蛋白质。蛋白质是不同种类的氨基酸以“脱水缩合”的方式经过特定的有机结合而组成的多肽链，在经过一定的卷曲、折叠和盘绕之后形成的具有不规则空间结构的化合物。蛋白质结构中含有氨基和羧基，因其空间位置和数量不同，经过不同或相同氨基酸結合形成的蛋白质就具有不同的性质和功能。人体在吸收消化蛋白质后得到氨基酸，再根据大脑信号和指令重新合成人体所需的蛋白质，比如白蛋白、球蛋白、血红蛋白、肌蛋白和载脂蛋白等，这些蛋白质会重新参与到人体的新陈代谢中，为人们每天的生理活动提供能量与支撑。

为了保证人体正常的新陈代谢和免疫功能，人每天必须食用一定量的蛋白质，否则就可能因蛋白质缺乏而患病，而精确评价蛋白质含量可以为人们更科学地选择食物提供方向。本文分析了蛋白质的性质，并综述了蛋白质含量检测方法的研究进展，比如凯氏定氮法、杜马斯燃烧法、分光光度法等，以期为相关研究者进一步找到准确科学的蛋白质含量检测方法提供依据。

一、蛋白质的性质

蛋白质含有氨基和羧基，兼有两性，还有水溶性，带电荷，可以利用这些性质，通过加入某些物质使蛋白质的空间结构改变，从而进行定量和定性检测。在强酸、强碱、重金属盐类等化学影响和高温、X射线等物理影响下，蛋白质都可能改变其分子的内部结构和性质，而且蛋白质具有某些特殊苯环、肽键，可以发生双缩脲的紫色反应和硝酸的黄色反应。

二、蛋白质的检测方法

蛋白质在不同食物中的含量不尽相同，准确知道其含量可以为人们合理选择食物提供参考。世界各国已有不少检测蛋白质的方法，但由于其空间结构和组成的复杂性，如何找到一种准确、快速、灵敏度高、检测成本低的检测方法，学者们还在不断探索。

目前文献报道的检测蛋白质含量的方法有很多，归纳起来可以分成三种。一是将蛋白质特有的氨基转化为挥发性的氨态氮，测定氮含量后，再根据氮的换算系数来计算得出蛋白质含量，比如凯氏定氮法、杜马斯燃烧定氮法等。二是利用蛋白质中官能团的化学反应产生有色物质，再检测吸光度和透光率，比如双缩脲反应、染料结合法、福林酚法等。三是是利用蛋白质的物理性质，如等电点、带电性、某些特征官能团具有红外吸收等原理，使用专用设备测试推算出含量，比如氨基酸分析法、高效液相色谱法、凝胶电泳法，此类方法多用于生物医学，在食品中的检测应用较少。

1.凯氏定氮法。凯氏定氮法主要是利用不同种类的蛋白质含有特定含量的氮，从而进行检测分析。将食品中的蛋白质与硝酸、硫酸铜、硫酸钾一起加热消化，分解产生的氨与硫酸反应生成硫酸铵，加入氢氧化钠等碱液后蒸馏得到氨气，用硼酸吸收后再用酸液滴定，得到滴定体积，根据氮的换算系数从而得到蛋白质含量，这是推算的结果。比如用凯氏定氮法检测鱼中的蛋白质含量，结果的准确性与氮换算系数和样品中测得氮的质量分数相关，但国标GB5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中未明确规定鱼类蛋白质的氮折算系数，计算时一般参照肉及肉制品的值6.25。查阅相关文献可知，40种不同鱼类的氮折算系数为7.0-7.5，都高于6.25，这给检测结果带来了一定的偏差。不过，不同部位、不同生长阶段、不同性别、不同来源组织的鱼的氮含量差异不大，基本都在某个特定值范围内。

对于食品中的非氨基酸态氮，比如尿素、嘌呤和嘧啶的碱基、氧化三甲胺、甜菜碱等具有一定的挥发性，建议用挥发性盐基氮的国标方法GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定，蛋白质的最终含量为凯氏定氮法测得的总氮量减去非氨基酸态氮含量。用半自动的凯氏定氮法检测阿胶食品和保健品中的蛋白质含量，氮的换算系数参考乳制品的值6.38，阿胶中的蛋白质含量为23.2g/100g-23.75g/100g。魏永义用凯氏定氮法测定鸡骨素中的蛋白质含量为24.8g/100g，变异系数为1.27%。

凯氏定氮法是目前的国标方法，也是经典方法，但操作比较繁琐，操作时间长，基本需要一天才能完成，虽然采用金属催化剂、金属盐类等可以使消化时间缩短，但过程中用到的试剂和产生的二氧化硫对人体和环境的污染较大。后来发展起来的定氮仪用半自动化的定氮功能解决了蒸馏的环境污染和危险问题，提高了效率，缩短了时间，但全自动的定氮仪价格较贵，增加了投入成本。

2.杜马斯燃烧法。杜马斯燃烧法也是通过测定氮含量来测定蛋白质，与凯氏定氮法不同的是，杜马斯燃烧法通过高温燃烧试样，在吸附处理掉干扰物后，还原成分子氮，再用气相色谱仪的热导检测器进行测定，具有分析时间短（5min以内就可以完成一个样品的检测）、试样需求量少的特点，可以明显提高效率，适应于绿色发展和绿色检测，刚好弥补了凯氏定氮法的缺点。

为了对比两种方法的优缺点，很多研究者进行了尝试。利用杜马斯燃烧法测定9种不同类别的食品中的蛋白质含量，比较RSD值、相对标准偏差和重复性，最终发现与凯氏定氮法的检测结果无差异。利用杜马斯燃烧法测定黄豆、奶粉和米粉中的蛋白质，通过考察通氧量的影响、反应炉温的影响、称样量的影响、试样的氮含量和状态的影响，对于固体样品，凯氏定氮法和杜马斯燃烧法的测定结果基本一致，并首次用于液体样品的检测，结果接近理论含量，也显示了良好的线性关系。利用杜马斯燃烧法和凯氏定氮法检测同一类物质，无论是15种不同蔬菜，还是精米和糙米等稻米，两种方法的精密度、准确度均无明显差异，而杜马斯燃烧法显示出了低成本、节约人力和时间、环境友好的优势。王铁良优化了提取温度、固液比、提取时间和次数，再用杜马斯法测定大豆中的水溶性蛋白质含量，结果比凯氏定氮法略高，并创造性地引入了蒸发和干燥程度，增加了进样量，使结果的准确度和精密度更有保证。易善平用杜马斯燃烧法和凯氏定氮法同时快速测定各种状态乳制品的含氮量，结果无明显差异。

对比实验过程和结果，杜马斯燃烧法比凯氏定氮法明显缩短了检测时间，试剂更环保和安全，废弃物相对减少，有效地保护了环境，而且实现了连续进样，缺点就是仪器较贵，但这并不影响杜马斯燃烧法成为欧美等国家法定检测乳制品的分析方法，加拿大、美国和德国甚至将其作为唯一检测特定领域蛋白质的标准。

3.分光光度法。分光光度法是利用某种物质与蛋白质发生反应，生成物具有一定的颜色和吸光度，从而用仪器进行检测的方法，这也是目前利用蛋白质的化学性质进行检测的最广泛的方法，具有设备简单易得、低成本、检验速度快、操作简单的特点，结果能够真实反映蛋白质的含量。但是目前是靠经验和间接验证得到反应等式，还未找到与蛋白质发生等量反应的通用试剂。

（1）双缩脲反应。在碱性溶液中，含有两个氨基甲酰基的蛋白質与铜离子反应生成紫红色络合物，在540nm处有最大吸收值。当条件一定时，蛋白质含量和反应颜色深浅正相关，这是肽和蛋白质特有的性质。张立娟用双缩脲法在20-30min内检测出大豆分离蛋白粉中的蛋白质含量，耗时比凯氏定氮法明显减少，而且对环境友好，但此法只能对水溶性蛋白质进行检测。在用双缩脲法进行检测时，难点在于找到合适的样品进行标定，这样才能保证结果准确可靠。

（2）染料结合法。染料结合法主要是针对同源蛋白质进行检测，操作简单，灵敏度高，可以同时检测多个样品并实现标准化操作。试样中的蛋白质与过量染料形成不溶性盐后析出沉淀，使用分光光度计检测反应前后的透明度变化。在食品蛋白质检测中，使用比较多的是考马斯亮蓝法和酸性橙12染色法。考马斯亮蓝法的检测原理是考马斯亮蓝G-250染料在酸性环境的吸收波长和与蛋白质结合后的吸收波长发生改变，2min之内呈色并在1h之内稳定，呈色由红色变成蓝色，吸光度与蛋白质含量呈正相关，重现性好;但在酸性条件下反应仅能检测水溶性蛋白质，有多糖物质存在时也有明显的干扰，而且不同蛋白质检测时颜色变化有明显差异，需要针对特定蛋白质制作标准曲线进行校正。酸性橙12染料能够检测水溶性蛋白质和不溶性蛋白质，对于多种食品和原料均能准确给出结果，同时用酸性橙12染料法和凯氏定氮法检测谷物种子的蛋白质含量和大豆蛋白，结果具有极高的相关性，具有可快速检测和低成本的优势。

（3）福林酚法。福林酚法是蛋白质测定最灵敏的方法之一，其显色原理与双缩脲法相同，再加入Folin酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐后，蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基将其还原产生深蓝色物质，在一定条件下蓝色深浅与蛋白质的含量成正比。此法可以检测到最低5μg含量的蛋白质，其灵敏度比双缩脲法高出100倍，缺点是废时长、干扰多、专一性较差，曲线为非线性，现已被考马斯亮兰法所取代。

食品中的蛋白质含量关乎大家的生命健康和生活质量，“三聚氰胺”和“动物水解蛋白”等食品安全事件的影响还未远去，蛋白质的精准测定方法亟需完善。凯氏定氮法因其应用广泛而成为其他方法的基础，但却无法区分是蛋白氮还是其他含氮物质，无法第一时间识别“三聚氰胺”风险，还需要其他方法验证;杜马斯燃烧法以其更环保、效率更高、操作成本更低、结果无差异化的优点而被越来越多地用于科学研究中，在解决设备投入大的缺点后，期待能够投入到日常的蛋白质检测中;分光光度法对于有特殊官能团的蛋白质能够显现特殊颜色，建立已知染料与蛋白质的等量反应可以提高结果的准确性;其他物理方法用于生物蛋白的检测较多。由于食品的复杂性和蛋白质种类的多样性，想要准确检测食品中蛋白质的含量，还需进一步研究非蛋白氮的检测，找到某些物质与蛋白质的等量反应。