响应面优化海洋放线菌DUT11 产衣霉素的发酵工艺*

徐小娜，牛海青，王晓霞，田 晴，高 茜

（咸阳职业技术学院 医药化工学院，陕西 咸阳 712000）

随着人类对天然药物的研究不断加深，海洋微生物逐渐成为人们研究的重点，海洋独特的环境造成了海洋放线菌的代谢途径独特复杂，从而使海洋放线菌产生的代谢产物复杂多样、结构新颖且具有较强生物活性[1]，从而为天然活性药物的开发提供一条重要途径。其中，衣霉素就是一种海洋放线菌来源的抗生素。衣霉素具有抗酵母菌、白色念珠菌、葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌等活性的核苷酸类抗生素[2-4]，可以开发为新型的抗真菌药物及农用杀虫剂。文献研究发现，衣霉素还具有明显的抗补体活性，并已证实了衣霉素降低补体系统的活性是通过阻断合成B、C2 和pro-C4 因子的糖基化，并抑制这些蛋白质的分泌。然而，目前关于海洋放线菌发酵合成衣霉素的工艺研究鲜有文献报道。因此，研究并开发基于海洋放线菌来源的衣霉素的发酵工艺，具有重要的理论意义及实际应用价值。

本文在前期研究的基础上，考察其抗补体活性代谢产物衣霉素的发酵工艺条件。研究通过单因素以及响应面法优化海洋放线菌株DUT11 的发酵工艺，进而提高衣霉素的产量，为衣霉素的研究开发提供一定的理论参考依据。

1 实验部分

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋放线菌DUT11（采自大连星海湾海底沉积物），菌种保存在-80°C 冰箱里。

1.1.2 培养基 所用的培养基的配方见表1。

表1 培养基Tab.1 Media

1.1.3 主要仪器和试剂

SW-CJ-2FD 型洁净工作台（苏州净化公司）；SX-300 型高压蒸汽灭菌锅（日本Tomy 公司）；ZQZYBG 型摇床（上海知楚仪器有限公司）；DH5000B 型恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；FreeZone R型冷冻干燥机（LABCONCO）。

衣霉素标准品（纯度≥98.0% 生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养与发酵条件

种子培养 将在甘油保存的菌种菌悬液涂布在5#固体培养基的平板上进行活化，28℃下培养4～8d后，刮取1cm2经活化过菌株的孢子，接种于250mL三角瓶中，其中种子液装有50mL，220r·min-1，28℃下培养3d 后得到种子液。

发酵过程 取4%的种子液接种于培养基中，于220r·min-1，28℃下培养6d。

1.2.2 样品制备 取3mL 发酵液于10000r·min-1离心10min，得到菌丝体和上清液，菌丝体用甲醇超声提取，收集菌丝体的甲醇提取物，将上清液和甲醇提取物合并后烘干，用1mL 甲醇超声溶解，再通过0.22μm 滤膜过滤得到样品，最后进行HPLC 分析。

1.2.3 衣霉素含量的测定 将衣霉素的标准品配制成1.0mg·mL-1的母液，倍半稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 和0.0156mg·mL-1等系列浓度，用HPLC（流动相水-乙腈；流速：0.6mL·min-1；C18制备柱：5μm，4.6×250mm，进样量15μL，检测波长260nm）通过面积归一法测定标准曲线（图1）。以峰面积为自变量，衣霉素浓度为因变量，得到衣霉素浓度C和峰面积的线性回归曲线，来测定衣霉素的含量。

1.2.4 单因素试验 采用单因素试验依次对基础培养基及其配方、发酵时间等液体发酵工艺参数进行逐一优化。每组试验重复3 次，对其代谢产物进行HPLC 分析，找到能产生衣霉素含量最大的单因素发酵培养基及其配方的含量和发酵条件。

1.2.5 响应面分析法优化发酵培养基及发酵条件 根据1.2.4 单因素试验结果，以筛选出可溶性淀粉、黄豆粉和时间作为试验因素，以衣霉素产量为响应值，采用响应面试验设计Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Behnken 设计三因素三水平的实验，并利用响应面法对菌株DUT11 最佳发酵工艺进行优化（表2）。

表2 响应面试验因素与水平Tab.2 Factors and levels of response surface methodology

1.3 模型的验证试验

将优化后的最佳预测值进行发酵试验，重复3次，取平均值。比较预测值和试验所得到的实际值，进一步验证响应面法所得到的预测值，来确定响应面法优化的发酵工艺是否准确可靠，是否具有实际的应用价值。

2 结果与讨论

2.1 绘制衣霉素的标准曲线

以峰面积为自变量，衣霉素浓度为因变量，得到衣霉素浓度C 和峰面积的线性回归曲线，其方程为y=8×10-5x-0.0201，R2=0.999，方程式中x 为峰面积，y为衣霉素的浓度。衣霉素标准曲线见图1。

图1 衣霉素标准曲线Fig.1 Standard curve of tunicamycin

2.2 单因素实验结果

2.2.1 基础培养基的筛选 取4%的同一批次种子液接种于7 种不同的培养基中（F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7），于28°C、220r·min-1条件下发酵6d，通过HPLC分析测定衣霉素的峰面积，计算衣霉素的产量。以衣霉素产量为指标，对菌株DUT11 的7 种液体培养基进行筛选，结果见图2。

图2 菌株DUT11 不同培养基下衣霉素的产量Fig.2 Yield of tunicamycin under different culture medium of strain DUT11

由图2 可知，F6培养基下衣霉素的产量最高，因此，选用F6培养基为基础培养基进行发酵优化。

2.2.2 可溶性淀粉的含量对菌株代谢产物中衣霉素产量的影响 将可溶性淀粉的含量调整为1%、2%、3%、4%、5%进行单因素实验，通过HPLC 分析，测定衣霉素的峰面积，计算衣霉素的产量。结果见图3。

由图3 可知，可溶性淀粉含量为3%时，衣霉素的产量达到最大，其衣霉素产量为50.2mg·L-1，再增加可溶性淀粉的含量，其菌株产衣霉素的含量反而下降。因此，基础培养基中可溶性淀粉含量为3%时，生产衣霉素的量最多。

图3 可溶性淀粉的含量对衣霉素产量的影响Fig.3 Effect of soluble starch content on the yield of tunicamycin

2.2.3 黄豆粉的含量对菌株代谢产物中衣霉素产量的影响 将黄豆粉的含量调整为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%进行单因素实验，通过HPLC 分析，测定衣霉素的峰面积，计算衣霉素的产量。

由图4 可知，黄豆粉含量为2%时，衣霉素的产量达到最大，衣霉素产量为51.1mg·L-1，再增加黄豆粉的含量，其菌株产衣霉素的含量反而下降。因此，基础培养基中黄豆粉含量为2%时生产衣霉素的量最多。

图4 黄豆粉的含量对衣霉素产量的影响Fig.4 Effect of soybean powder concent on the yield of tunicamycin

2.2.4 酵母粉的含量对菌株代谢产物中衣霉素产量的影响 将酵母粉的含量调整为0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%进行单因素实验，通过HPLC分析，测定衣霉素的峰面积，计算衣霉素的产量。

由图5 可知，酵母粉含量为0.25%时，衣霉素的产量达到最大，衣霉素产量为42.9mg·L-1，再增加酵母粉的含量，其菌株产衣霉素的含量反而下降。因此，基础培养基中酵母粉含量为0.25%是生产衣霉素的最适宜浓度。

图5 酵母粉的含量对衣霉素产量的影响Fig.5 Effect of yeast powder concent on the yield of tunicamycin

2.2.5 不同发酵时间对菌株代谢产物中衣霉素产量的影响 将发酵时间调整为3、4、5、6、7d 进行单因素实验，通过HPLC 分析，测定衣霉素的峰面积，计算衣霉素的产量。结果见图6。

图6 发酵天数对衣霉素产量的影响Fig.6 Effect of fermentation days on the yield of tunicamycin

由图6 可知，菌株DUT11 的代谢产物在不同的发酵时间，其衣霉素的产量表现出明显的不同，发酵6d时衣霉素的产量达到最大，衣霉素产量为50.7mg·L-1，再增加发酵天数，其菌株产衣霉素的含量反而下降。因此，确定发酵6d 为最佳的发酵时间。

2.3 响应面优化结果及分析

2.3.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验所得的结果，以可溶性淀粉的含量，黄豆粉的含量和发酵天数为自变量，进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计，对这17 组实验进行研究，结果见表3。

表3 响应面优化结果Tab.3 Results of response surface

2.3.2 模型建立与方差分析 根据表3 的试验结果，通过Design-Expert 8.0.6 软件处理数据进行回归拟合，得到的方差分析见表4，得到的二次多项式回归方程：Y=50.65+0.56A+4.45B+0.25C+0.072AB-0.66AC-0.94BC-1.47A2-1.36B2-5.67C2。

表4 回归方程方差分析Tab.4 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表4 可知，P 值小于0.0001，说明该回归方差模型是极显著，决定系数R2值为0.9933，失逆项P值为0.0631 大于0.05 不显著，说明模型的拟合度很好，由所选变量引起的响应值为99.33%，表明实际值与预测值比较接近，可以采用此模型对衣霉素产量的发酵工艺参数进行预测。方差分析的结果显示，B 和C2对衣霉素产量有极显著的影响（P 值小于0.0001），A、BC、A2和B2均为显著影响因素，C、AB和AC 影响均不显著。由F 值推断，3 个因素对衣霉素产量的影响大小依次为：黄豆粉的浓度（B）＞可溶性淀粉的浓度（A）＞发酵天数（C）。

2.3.3 响应面分析 响应面是各试验因子A、B 和C 值对响应值Y 构成的三维空间曲面图，从响应面分析图能直观地看出各因素与响应值的交互作用。通过Design-Expert 8.0.6 软件处理数据得到响应面分析，结果见图7～9。

图7 可溶性淀粉与黄豆粉的浓度对衣霉素产量的影响Fig.7 Effect between soluble starch with soybean powder concentration on the yield of tunicamycin

图7为可溶性淀粉的浓度（A）与黄豆粉的浓度（B）对衣霉素产量的影响。发酵天数为6d 时，由图7（a）可知，随着可溶性淀粉和黄豆粉浓度的增加，衣霉素产量提高无明显变化；由图7（b）可知，可溶性淀粉的浓度与黄豆粉浓度变化的交互作用不显著。

图8 为可溶性淀粉的浓度（A）与发酵天数（C）对衣霉素产量的影响。

图8 可溶性淀粉浓度与发酵天数对衣霉素产量的影响Fig.8 Effect between soluble starch concentration with fermentation days on the yield of tunicamycin

黄豆粉含量为2%时，由图8（a）可知，随可溶性淀粉和发酵天数的增加，衣霉素产量无明显提高，即可溶性淀粉浓度与酵母粉浓度变化交互作用不显著。

图9 为黄豆粉的浓度（B）与发酵天数（C）对衣霉素产量的影响。可溶性淀粉的含量为3%时，由图9（a）可知，黄豆粉对衣霉素产量的影响显著，曲线比较陡；由图9（b）可知，黄豆粉的浓度与发酵天数变化的交互作用较为显著。

图9 黄豆粉的浓度与发酵天数对衣霉素产量的影响Fig.9 Effect between soybean powder concentration with fermentation days on the yield of tunicamycin

2.4 验证试验与结果

根据响应面软件分析预测到最佳的工艺条件为：可溶性淀粉的含量（A）、黄豆粉的含量（B）和发酵天数（C）分别为4%、2.5%和5.88d，理论上可产生衣霉素的量为52.98mg·L-1，根据实际情况，将最佳工艺条件调整为：可溶性淀粉的含量为4%、黄豆粉的含量为2.5%，发酵天数为6d，为了检验模型预测的准确性，按上述工艺条件进行实验，重复3 次，衣霉素的产量的平均值为53.15mg·L-1，其实验结果与预测值相近，说明此模型合适可靠。

3 结论

对海洋放线菌DUT11 产衣霉素的发酵工艺进行优化，首先，通过单因素试验对海洋放线菌的基础培养基、发酵时间进行筛选并优化，得到基础培养基为F6，发酵时间为6d。在单因素试验基础上，通过Design Expert Design-Expert 8.0.6 软件，采用Box-Behnken 设计对衣霉素产量的工艺进行优化。通过3次实验验证，在初始pH 值为7.0、可溶性淀粉4%，黄豆粉2.5%，酵母粉0.25%，KH2PO40.25%，CaCO30.3%，于220r·min-1，28℃下培养6d，在此条件下衣霉素的产量为53.15mg·L-1。实验结果可为衣霉素以后的发展应用提供参考数据。