Box-Behnken 响应面法优化柴胡多糖的超声提取工艺*

陈雁雁，赵雅兰，张淑香，张洪财，王文姌

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国药科大学，江苏 南京 211198；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

柴胡（Bupleuri Radix）为临床常用中药材，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气，缓解抑郁的功能[1]。其分离出的柴胡多糖不仅无毒副作用，而且还有一系列的药理作用[2]。近几年研究表明，柴胡多糖会通过中断HMGB1-TLR4 途径而提供保护作用，从而抑制肾脏炎症和纤维化过程[3]。Yuchen Feng 等通过小鼠实验发现柴胡多糖可改善由链脲佐菌素诱导的糖尿病性肾病，其对小鼠糖尿病性肾病的作用与调节肠道菌群和炎症有关[4]。这都表明，柴胡多糖有着巨大的开发价值和应用前景。

超声提取法（Ultrasonication Extraction）是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法。相对于传统提取方法，超声提取法有操作方便、溶剂选择性强、提取率高等优点[5,6]；可将提取时间缩短2/3，并对热不稳定药材成分与易水解易氧化的药材成分有保护作用[7]。

本文采用超声提取法对柴胡多糖的得率与含量进行了研究，以确定柴胡多糖的最佳提取工艺，为后续柴胡多糖的进一步研究提供了参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

柴胡（黑龙江中医药大学第一附属医院，经黑龙江中医药大学药学院生药学教研室鉴定为正品）。

苯酚（AR 天津奥普升化工有限公司）；无水葡萄糖对照品（成都乐美天医科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

岛津UV-1800 型紫外-可见分光光度计（岛津企业管理有限公司）；DK-98-1 型超级恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH-300E 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；R2003KB型旋转蒸发仪（SENCO Technology Co., Ltd.）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；AL204 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DZF-6020MBE 型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DC-200 型高速多功能粉碎机（浙江武义鼎藏日用金属制品厂）。

1.3 糖含量标准曲线的建立

采用“苯酚-浓硫酸法”进行测定[8]。

葡萄糖标准溶液的配制 取葡萄糖对照品适量，加蒸馏水制成0.2mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液。分别精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 放置于10mL 容量瓶中，分别加水补至2mL，摇匀。

检测波长的选择 在2mL 的葡萄糖梯度溶液中各加5%苯酚试液1.0mL，摇匀，均匀滴加浓H2SO47.0mL，摇匀，静置10min，再置沸水浴中加热15min，取出，冷却至室温，在200～800nm 扫描。结果得到在488nm 波长处有最大吸收，故选择488nm 为检测波长。

标准曲线的制备 以对照品浓度C（mg·mL-1）为横坐标，吸光度A 为纵坐标，得到回归方程：Y=53.65X+0.0203，r2=0.9983。试验结果表明，浓度在0.00～0.02mg·mL-1的范围内曲线线性良好。

样品的测定 精密称取超声提取的干燥恒重柴胡多糖20mg，置100mL 容量瓶中加水溶解定容，按照检测波长下的操作配制样品溶液，于488nm 处测定其吸光度。

1.4 换算因子的测定[9,10]

按照1.3 项下样品溶液配制方法配制溶液，测定吸光度后计算其浓度。

式中 W：多糖质量，mg；D：多糖的稀释因子；C：多糖溶液中葡萄糖浓度，mg·mL-1。

结果得出，超声提取多糖对葡萄糖的换算因子为5.71。

1.5 柴胡多糖测定与计算

式中 C：样品葡萄糖浓度，mg·mL-1；D：样品溶液稀释倍数；f：换算因子；W：供试品重量，mg。

1.6 超声提取柴胡多糖工艺路线

准确称取柴胡多糖2.0g，以1∶20 的料液比加入蒸馏水，超声时间为20min，超声2 次，合并滤液，用双层纱布过滤。减压浓缩滤液至20mL，加乙醇至醇浓度为75%，放置24h，抽滤，待试剂挥干后置干燥箱中干燥至恒重，所得粉末即为柴胡粗多糖。

1.7 单因素实验

（1）超声提取次数的影响 超声次数设定为1、2、3、4 次，其他条件不变，平行试验两次。

（2） 超声提取时间的影响 超声时间设定为10、15、20、25、30min，其他条件不变，平行试验两次。

（3）超声料液比的影响 料液比设定为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），其他条件不变，平行试验两次。

1.8 Box-Behnken 响应面法超声工艺优化

采用Box-Behnken 响应面法对柴胡多糖的超声提取工艺进行优化。以单因素考察的实验结果为依据，选择超声时间（A）、超声次数（B）、料液比（C）为因素，综合评分（Y）为响应值，采用Design-Expert 12 软件设计3 因素3 水平响应面试验。因素水平见表1。其综合评分的计算公式为：

表1 响应面分析因子与水平Tab.1 Response surface analysis factor and horizontal table

综合评分（%）=（多糖得率/得率最高值）×30%+（多糖含量/含量最高值）×70%

2 结果与讨论

2.1 单因素考察结果

2.1.1 超声提取次数的优化结果

超声提取次数优化结果见图1。

图1 超声提取次数对柴胡多糖得率和含量的影响Fig.1 Effect of ultrasound extraction times on the yield and content of Bupleurum polysaccharide

由图1 可知，随着超声次数的增加，多糖得率一直增加；在提取第3 次时多糖含量略微下降，故选择超声次数为2 次比较合适。

2.1.2 超声提取时间的优化结果

超声提取时间优化结果见图2。

图2 超声提取时间对柴胡多糖得率和含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on the yield and content of Bupleurum polysaccharide

由图2 可知，随着超声时间的增加，多糖含量与多糖得率也在增加，在25min 时，柴胡多糖的得率与含量都达到最高点，25min 后两者都略微减小，可能是因为超声波剪切作用时间过长，破坏了多糖结构，故选20～30min 进行优化。

2.1.3 料液比的优化结果

超声提取料液比优化结果见图3。

图3 超声料液比对柴胡多糖得率和含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic solid-liquid ratio on yield and content of Bupleurum polysaccharide

由图3 可知，料液比在10～20（mL∶g）时，多糖得率和含量随着料液比的增大而增大，当料液比超过20（mL∶g）时，多糖得率和含量都不同程度的减少，可知料液比为1∶20 比较合适，并选择15～25mL·g-1进一步优化。

2.2 响应面法优化结果

2.2.1 Box-Benhnken 试验结果

表2 响应面试验结果Tab.2 Test results of respome swrface

2.2.2 方差分析和二元回归方程拟合

使用Design-Expert 软件对数据进行二次多元回归方程拟合。

由表3 可知，实验模型F 值为34.70，P 小于0.0001，表明回归模型极显著；失拟项F=0.016，P 大于0.05，说明该模型拟合程度较好，能准确描述实验结果，可用此模型对柴胡多糖含量进行分析和预测。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression model

本实验分析得到的柴胡多糖含量的二次多元回归方程：Y=95.57+1.64A+5.49B+11.59C-0.2949AB+0.2384AC+0.2515BC-6.22A2-4.63B2-10.86C2

2.2.3 交互作用分析

超声次数和料液比对柴胡多糖提取量的响应面分析见图4。

由图4 可知，超声次数和料液比的响应曲面均向下弯曲，超声次数对柴胡多糖的提取影响更大。根据图4 中可确定两因素最佳水平参数为：超声次数2 次左右，料液比在1∶19～1∶21（g∶mL）之间。

图4 超声次数、料液比交互作用的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic times and solid-liquid ratio

图5为超声次数、超声时间交互作用的响应面图和高等线图。

由图5 可知，超声次数与超声时间响应曲面均向下弯曲，超声次数对柴胡多糖提取影响更大。确定两因素最佳水平参数为：超声次数2 次左右，超声时间在24～26min 之间。

图5 超声次数、超声时间交互作用的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour map ofinteraction between ultrasonic times and time

图6为料液比、超声时间交互作用的响应面图和等高线图。

图6 料液比、超声时间交互作用的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour map of interaction between solid-liquid ratio and time

由图6 可知，等高线呈圆形，两者的交互作用相当。确定两因素最佳水平参数为：料液比在1∶19～1∶21（g∶mL）之间，超声时间在24～26min 之间。

根据Design-Expert 12 统计软件，以综合评分Y 值最大值为指标，分析得到最佳提取工艺为：超声时间26min，料液比1∶21（g∶mL），超声次数为2 次，综合评分99.47%。

2.3 验证试验

精密称取柴胡药材10g，以在最优工艺的条件下平行操作3 次，计算柴胡多糖得率与含量的平均值，结果得到多糖得率11.31%，多糖含量67.13%，综合评分98.82%。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取葡萄糖标准品溶液于488nm测定6 次，得到RSD 为0.15%。

2.4.2 稳定性试验 取各提取方法下同一批次的供试品溶液，在对应的测定波长下，分别于0、30、60、90、120、150min 测定，得到RSD 为1.01%。

2.4.3 重复性试验 相同条件下制备的6 份柴胡多糖供试液，在对应的测定波长下测吸光度A，计算RSD 为1.14%。

2.4.4 加样回收实验 精密称取各提取方法下已知含量的同一柴胡供试品6 份，分别加入一定量标准品，按照样品制备和含量测定方法项下操作，测定回收率。结果见表4。

表4 葡萄糖标准品加样回收试验Tab.4 Recovery test of glucose standard sample

3 结论

多糖是生命活动中必需的大分子之一[11]，具有多种生物活性[12]，可发挥抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等作用[13-15]。多糖极性大，易溶于水[16]，若选用高温提取、酸性或碱性提取，会使糖苷键断裂，破坏多糖结构，故可采用超声结合水提醇沉法来提取，成本较低，操作方便。

本文通过单因素考察和BBD 实验研究了超声时间、料液比、超声次数3 个因素对柴胡多糖提取的影响，既提高了柴胡多糖的得率，又避免了柴胡多糖含量的损失。经优化后得到柴胡多糖的最佳提取工艺参数为：超声时间26min，料液比1∶21（g∶mL），超声次数为2 次。在最佳提取工艺条件下的多糖得率为11.31%，多糖含量为67.13%，综合评分为98.28%，与预期值99.47%相近，说明该工艺优化结果合理可行，为下一步柴胡多糖的抗抑郁研究奠定了基础。