菌糠资源化开发中激素类物质检测及利用

杨林英，徐凡，耿培妍，尹显达，耿丹萌，王谦

(河北大学 生物工程技术创新中心，河北 保定 071002)

在绿色发展理念下，食药用真菌对各种农林废弃物的分解利用，成为当前国内重要的解决生态环境中农业面源污染的技术与产业方向之一；黑木耳现在成为国内栽培规模最大的品种，在生态循环中，其产业发展产生的菌糠成为随之出现需要解决的问题，其资源化利用就成为科技部、农业农村部引导的领域重点研发方向之一；菌糠中含有丰富的菌丝蛋白、脂肪、菌丝体的次生代谢产物和钙、磷、钠等多种微量元素[1-2].目前，黑木耳菌糠大部分被丢弃在田间地头、河流两岸，不但造成资源浪费，还会造成环境污染[3-5].本团队早在利用中国第17颗返回式卫星开展《卫星搭载食用真菌菌种应用研究》中，就发现食用菌菌丝体中，存在激素类物质，因此，菌糠中激素类物质的检测及相关应用是其资源化开发的技术途径之一.

测定激素类物质的方法有很多种，主要分为3大类：生物学鉴定法、免疫学方法、物理化学法.生物学鉴定法的周期长，准确度不高[6]；免疫学方法虽灵敏度高，但是制备抗体比较复杂[7]；物理化学方法中最常用的是分光光度法、高效液相色谱法、高效气相色谱法，色谱法灵敏度高、选择性好，但是该种方法仪器价格昂贵，对样品前处理要求高，因为其分辨有一定的限度，若达不到一定的纯度要求，可能会出现一种以上的化合物保留时间接近甚至相同，对检测结果有一定的影响[8].分光光度法相比较色谱法而言，更加经济，简易，实用，易操作[9].

目前国内外对黑木耳菌糠中激素类物质含量测定的研究比较少，对黑木耳菌糠中激素类物质的进一步研究，能够帮助人们进一步探索黑木耳菌糠的资源化开发利用，也是本团队作为河北省现代农业黑木耳产业体系的岗位任务.本文采用分光光度法对黑木耳菌糠中的赤霉素、吲哚乙酸进行了含量测定，并且选择生长较快、口感好、营养成分独特、营养价值高且具有观赏性的紫叶生菜品种[10]，初步探索了黑木耳菌糠与菜园土、砂质土不同质量配比对紫叶生菜生长的影响.

1 材料与试剂

黑木耳菌棒(常规杂木屑配方材料)：选自河北省现代农业产业体系黑木耳综合实验站.

紫叶生菜种子：市购.

试剂A：15 mL 0.5 mol/L 的FeCl3,300 mL体积分数为96%的浓硫酸，500 mL蒸馏水，使用前混匀即可，避光保存.

2 实验方法

2.1 黑木耳菌糠中激素类物质含量的测定

2.1.1 标准曲线的绘制

2.1.1.1 赤霉素标准曲线的绘制

分别配置质量浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0 μg/mL的赤霉素标准溶液，各取2 mL(即质量分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0 μg)于5 mL的具塞刻度试管中，40 ℃水浴加热直至液体蒸干，冷却后加2 mL体积分数为80%的甲醇溶解，再分别加入体积分数85%的浓硫酸3 mL，加塞摇匀，室温下放置40 min后，于412 nm波长处测定吸光度值.标准曲线的横坐标为赤霉素质量(μg)，纵坐标为吸光度值.

2.1.1.2 吲哚乙酸标准曲线的绘制

分别配置质量浓度为0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0，20.0、25.0 μg/mL的吲哚乙酸标准溶液，各取2 mL(即质量分别为0、1.0、2.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg)于5 mL的具塞刻度试管中，40 ℃水浴加热直至蒸干，冷却后加2 mL体积分数为80%的甲醇溶解，然后分别加入配置好的试剂A溶液8 mL，于40 ℃恒温水浴锅放置30 min后，于530 nm波长处测定吸光度值.以吲哚乙酸的含量(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线.

2.1.2 样品处理

用电热鼓风干燥箱将采收后的新鲜、无霉变的黑木耳菌棒烘干，粉碎机粉碎后过40目(孔径425 μm)筛网，用于后续实验.

称取5 g干燥的黑木耳菌糠于250 mL锥形瓶中，再加入预冷的体积分数为80%的甲醇50 mL，于4 ℃条件下浸提12 h后，在4 ℃ 3 500 r/min条件下离心20 min，收取上清液，沉淀用10 mL体积分数80%的甲醇溶解并在同样离心条件下重复离心15 min，离心共重复3次，合并上清液，即为黑木耳菌糠初提液.

取菌糠初提液2 mL，加等体积石油醚(为了除去部分色素和脂质)萃取脱色3次，弃醚相，调pH值至2. 加2 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，黑木耳菌糠中的激素类物质即在酯相中.

2.1.3 赤霉素含量测定

取2 mL有机相，40 ℃水浴加热直至液体蒸干，加2 mL体积分数80%的甲醇溶解，加3 mL体积分数85%的浓硫酸摇匀，40 min后于412 nm下测吸光度值.

2.1.4 吲哚乙酸含量测定

取2 mL有机相，40 ℃水浴加热直至液体蒸干，加2 mL体积分数80%的甲醇溶解，加8 mL试剂A，40 ℃恒温水浴锅放置30 min，于530 nm下测吸光度值.

2.1.5 回收率的测定

为了验证本文中赤霉素和吲哚乙酸提取、测定方法的可靠性，在黑木耳菌糠中分别添加赤霉素、吲哚乙酸标准品，采用同样方法提取、纯化和测定，最后计算赤霉素和吲哚乙酸标准品的回收率.

2.2 黑木耳菌糠对紫叶生菜发芽率及发芽时间的影响

2.2.1 黑木耳菌糠的预处理

将粉碎后的无霉变、无污染的黑木耳菌糠在阳光下暴晒3 d，然后加水搅拌均匀，水的质量分数控制在60%～70%.选择晴朗无风的洁净地面进行堆积，第1层铺搅拌均匀的湿菌糠，然后再撒1层微生物菌剂，将湿菌糠和微生物菌剂依次交错堆积.用木棍在堆中插孔，堆积物表面覆盖塑料薄膜从而达到保湿、保温的效果.每间隔5 d翻堆1次，并加入适量的水补充水分，翻堆要翻透彻，使黑木耳菌糠发酵均匀.

2.2.2 黑木耳菌糠对紫叶生菜生长的影响

按照表1中列举的不同配方，将处理好的黑木耳菌糠与砂质土、菜园土进行配比.混合均匀后放入穴盘中，不要压实，要保证良好的透气性，用水浇湿.在每个穴盘放5粒紫叶生菜菜籽，然后洒上1层薄土覆盖种子.在穴盘上盖上报纸，每天喷2次水.将穴盘放置于25 ℃左右的生长环境下，记录在不同配方下紫叶生菜的发芽率和发芽时间.依据记录的相关数据，确定适宜的菌糠添加量.

表1 黑木耳菌糠、砂质土、菜园土不同混合比例Tab.1 Different proportion of Auricularia auricula bran, sandy soil and soil square

3 结果分析

3.1 黑木耳菌糠中激素类物质含量测定结果

3.1.1 赤霉素、吲哚乙酸标准曲线的绘制

根据数据分别绘制赤霉素和吲哚乙酸标准曲线，结果如图1和图2所示.

图1 赤霉素标准曲线Fig.1 Standard curve of gibberellins

图2 吲哚乙酸标准曲线Fig.2 Standard curve of indoleacetic acid (IAA)

3.1.2 赤霉素、吲哚乙酸含量测定

结合吸光度值及标准曲线计算黑木耳菌糠中赤霉素和吲哚乙酸的含量，结果如表2和表3所示.

表2 黑木耳菌糠中赤霉素含量Tab.2 Content of gibberellins in Auricularia auricula bran

表3 黑木耳菌糠中吲哚乙酸含量Tab.3 Content of IAA in Auricularia auricula bran

由表2和表3可知，黑木耳菌糠中赤霉素质量分数为45.52 μg/g，吲哚乙酸质量分数为38.42 μg/g，说明黑木耳菌糠能够为植物生长提供一定量的激素类物质.

3.1.3 回收率

在黑木耳菌糠中添加赤霉素和吲哚乙酸标准品，经过同样方法的处理后分别测得赤霉素和吲哚乙酸标准品的回收率如表4所示.

表4 标准品的回收率Tab.4 Recovery of standard

由表4可知，添加赤霉素和吲哚乙酸标准品的平均回收率分别为98.28%和94.70%，证实该研究中采用的赤霉素和吲哚乙酸的测定方法可靠.

3.2 黑木耳菌糠不同配比对紫叶生菜发芽率、发芽时间的影响结果

不同比例的黑木耳菌糠栽培紫叶生菜，对其发芽率和发芽时间的影响结果如表5所示.

表5 黑木耳菌糠不同配比对紫叶生菜发芽率和发芽时间的影响Tab.5 Effects of different proportion of Auricularia auricula bran on germination rate and average germination time of purple leaf lettuce

由表5可知，配方3种植的紫叶生菜与其他配方相比，发芽率最高，而且与其他配方呈现极显著性差异，发芽时间最短；配方2和配方1的发芽率逐渐降低，发芽时间逐渐增长;配方1抑制了紫叶生菜生长.

4 结论

黑木耳菌糠中含有赤霉素和吲哚乙酸；与对照相比，一定比例的黑木耳菌糠的使用，可以提高紫叶生菜发芽率、缩短发芽时间；研究初步表明黑木耳菌糠可以为植物的生长发育提供一定量的激素类物质.通过对比含不同比例的黑木耳菌糠配方对紫叶生菜发芽率、发芽时间的影响结果发现，当添加35%(质量分数)的黑木耳菌糠时，栽培出来的紫叶生菜发芽率可达86.91%，而且发芽时间最短，约为7 d.绿色发展理念下，菌糠中激素类物质的检测及相关应用为黑木耳菌糠资源化开发利用提供了一种生态循环技术路径.菌糠添加量为55%时抑制紫叶生菜生长，具体原因还需要进一步探究.